Μοριακή και βιοχημική μελέτη μιας νέας ανθρώπινης ριβονουκλεάσης

Abstract

It is very well known that the metabolism of RNA includes a great variety of enzymatic reactions, the most important of which are catalyzed by ribonucleases (RNases). Ribonucleases are enzymes that cleave RNA and compose a wide protein family, present in all organisms. The initial isolation and characterization of bovine pancreatic RNase A was followed by the isolation of ribonucleases from a wide spectrum ofprokaryotic and eukaryotic organisms. Extensive studies in this field have lead in recent years to the isolation of many homologous ribonucleolytic enzymes. It is of significant interest that apart from their main ribonucleolytic activity many RNases exhibit important roles in biological functions such as angiogenesis, immunosupression, antitumor activity, antibacterial activity etc. Human ribonucleases have been in the epicenter of interest for a very long time and have been extensively studied. In our laboratory a specific RNase, designated as Cc RNase, has been isolated from the insect Ceratits capitata and has been fully characterized in the biochemical level. The objective goal of this PhD thesis was the molecular and biochemical characterization of the homologous human ribonucléase, which is designated as the human RNase κ. Our first goal was to isolate and subione the cDNA clone that codes for the human RNase k. The reverse transcription of poly (A)+ RNA, isolated from human placenta, resulted in the isolation of a 466 bp cDNA clone, which contains an open reading frame of 297 bp that codes for a protein of 98 amino acids; the human RNase K. The gene that codes for the human RNase κ (MGC71993) is represented a single time in the human genome and is located on chromosome 17 (17pl3.1), which corresponds to the LOC440400 gene locus. The gene retains the pattern of gene organization that is represented by all member of the protein family and consists of 3 exons interrupted by 2 introns. A homology search for the human RNase κ amino acid sequence against a variety of protein databases did not reveal any homology under statistical significant level with other ribonucleases. However a TBLASTN homology search against nucleotide databases revealed numerous homologs encoding proteins of unknown function. These EST sequences are present in at least 65 different animal species and encode proteins of 95-101 amino acids. Protein alignment of the human RNase κ and homologous amino acid sequences revealed a high degree of amino acid conservation. Phylogenetic analysis revealed that all homologs are members of the same orthologous protein family. This novel protein family, designated as RNase κ family, is conserved from C.elegans to humans. In our attempt to express the recombinant human RNase κ in prokaryotic expression systems a variety of expression vectors including pET-15b, pET-20b, pET29b, pET-cocol και pET-39b were used. In all cases the induction ofthe transformed bacterial liquid cultures with IPTG or the CE6 bacteriophage resulted in an intense inhibition of cellular growth. A possible explanation for this inhibition is that the expressed recombinant human RNase κ is toxic to E. coli cells. A far as the expression of the human RNase κ is concerned analysis of the retrieved EST sequences showed that the human RNase κ is expressed in a wide variety of normal and cancer tissues and is also expressed in all human developmental stages. Furthermore, Northern Blot analysis revealed a main mRNA transcript that is present in all tissues examined as well as the existence of two longer mRNA transcripts present only in brain, placenta and pancreas. In our effort to reduce the toxicity effect the human RNase κ coding region was cloned to pSCREEN l(b)+ expression vector. Using this plasmid the recombinant protein is expressed as a fusion protein fused with the main capsid protein of the T7 bacteriophage. As a result no inhibition of cell growth was observed using this expression system. The recombinant fusion protein was purified using a SepharoseNi⁺⁺ column and was then digested with thrombin. The fragment containing the pure human RNase κ was isolated using the same column. The application of this protocol had as a result the isolation of very small amounts of pure recombinant human RNase κ, which at the same time exhibited very little ribonucleolytic activity. Therefore our efforts to express the recombinant human RNase κ were turned to the use of the eukaryotic system of the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The cDNA of the human RNase κ was subcloned into the pPICZaA expression vector, which after its linearization was electroporated into the genome of KM71 P. pastoris host cells. The transformed clones were subjected to protein induction and an RNase inducing clone was used for the expression of the recombinant human RNase κ. The recombinant human enzyme was purified to homogeneity via Sepharose-Ni⁺⁺ chromatography and the ribonucleolytic activity of the recombinant enzyme was further studied. The biochemical characterization of the recombinant human RNase κ proved that the recombinant enzyme: • Preferentially cleaves ApU>ApG>UpU phosphodiester bonds. • Degrades the synthetic substrates poly (U) and torula yeast RNA, while it cleaves the natural substrates of 28S and 18S rRNA. • Its ribonucleolytic activity is linear with increasing enzyme concentration and incubation time. • Its ribonucleolytic activity remains unaffected in the presence of divalent cations such as Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ and Mn⁺⁺, while it is inhibited by Zn⁺⁺, Cu⁺⁺, Hg⁺⁺ and Fe⁺⁺. • It is a thermo labile molecule and is fully active in a wide range of pH values from 5-8, while it displays its maximum activity at pH 8.0. • The ribonucleolytic activity of the human RNase κ is fully inhibited in the presence of the reducing agent DTT, while alkylating agents such as NEM and iodoacetamide do not affect its enzymatic activity. • Finally the ribonucleolytic activity of the human RNase κ is not inhibited by the placental RNase inhibitor, which is the most important inhibitor of the RNases belonging to the RNase A superfamily. In summary, the characterization of the human RNase κ as the second member of a novel RNase family establishes the identification of the RNase κ family in metazoans. The nucleotide base specificity of the recombinant human representative, its lack of any significant homology to the members of the RNase A family and the fact that the human counterpart evades the placental ribonuclease inhibitor prove that there is no evolutionary relationship between RNase A and k families. The high conservation of all members of this RNase family in combination with the fact that the human enzyme is found to be expressed in all developmental stages and tissues suggest a very important biological function for this molecule.

Είναι γνωστό ότι ο μεταβολισμός των διαφόρων RNA μορίων περιλαμβάνει μια μεγάλη ποικιλία ενζυμικών αντιδράσεων, στις οποίες το σημαντικότερο ρόλο διαδραματίζουν αυτές που καταλύονται από τις ριβονουκλεάσες. Οι ριβονουκλεάσες είναι ένζυμα διάσπασης του RNA και απαρτίζουν μια μεγάλη υπεροικογένεια πρωτεϊνικών μορίων, που απαντούν σε όλους τους οργανισμούς. Την αρχική απομόνωση και χαρακτηρισμό της βόειας παγκρεατικής RNase A ακολούθησε η απομόνωση πληθώρας ριβονουκλεολυτικών ενζύμων από ένα ευρύ φάσμα προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισμών. Εκτεταμένες μελέτες στον τομέα αυτό έχουν οδηγήσει τα τελευταία χρόνια στην ταυτοποίηση πολλών ομόλογων ριβονουκλεασών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ορισμένες από τις ριβονουκλεάσες αυτές, εκτός από ριβονουκλεολυτική ενεργότητα, διαδραματίζουν σημαντικό βιολογικό ρόλο σε βασικές βιολογικές και κυτταρικές λειτουργίες, όπως η αγγειογένεση, η ανοσοκαταστολή, η αντικαρκινική και αντιβακτηριακή δράση κ.α. Οι ανθρώπινες ριβονουκλεάσες βρίσκονται στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος τα τελευταία χρόνια και έχουν μελετηθεί εκτεταμένα. Στο εργαστήριο Βιοχημείας του Πανεπιστημίου της Αθήνας έχει απομονωθεί και μελετηθεί σε βιοχημικό επίπεδο μια ριβονουκλεάση από το έντομο Ceratitis capitata, η οποία ονομάστηκε Cc RNase. Στόχος της παρούσης διδακτορικής διατριβής ήταν η μοριακή και βιοχημική μελέτη της ομόλογης ανθρώπινης πρωτεΐνης, δηλαδή της ανθρώπινης RNase κ. Για το σκοπό αυτό αρχικά εντοπίστηκε και κλωνοποιήθηκε το cDNA που κωδικοποιεί την ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ. Από την αντίστροφη μεταγραφή απομονωμένου από ανθρώπινο πλακούντα poly (Α)⁺ mRNA με τη βοήθεια κατάλληλων εκκινητών προέκυψε ένας cDNA κλώνος μήκους 466 ζευγών βάσεων, ο οποίος περιλαμβάνει ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης μήκους 297 ζευγών βάσεων αλλά και τις 5' και 3' αμετάφραστες περιοχές του. Το ανοικτό αυτό πλαίσιο ανάγνωσης κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μήκους 98 αμινοξικών καταλοίπων, την ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την ανθρώπινη RNase κ (MGC71993) εντοπίζεται σε ένα μοναδικό αντίγραφο στο χρωμόσωμα 17 και συγκεκριμένα στη θέση 17ρ13.1 του γενετικού χάρτη (LOC440400 gene locus), ενώ ταυτόχρονα διατηρεί το πρότυπο της γονιδιακής οργάνωσης των υπόλοιπων μελών της οικογένειας αποτελούμενο από 3 εξώνια και 2 εσώνια. Η έρευνα ομολογίας της προβλεπόμενης αμινοξικής ακολουθίας της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ σε πρωτεϊνικές βάσεις δεδομένων δεν έδειξε την ύπαρξη ομολογίας μεταξύ της πρωτεΐνης αυτής και άλλων γνωστών ριβονουκλεασών. Αντίθετα, η TBLASTN έρευνα ομολογίας σε νουκλεοτιδικές βάσεις δεδομένων αποκάλυψε ότι ένας μεγάλος αριθμός αλληλουχιών, που κωδικοποιούν υποθετικές πρωτεΐνες άγνωστης λειτουργικότητας παρουσιάζει υψηλό βαθμό ομοιότητας με την αμινοξική αλληλουχία της ανθρώπινης RNase κ. Οι αλληλουχίες αυτές απαντούν σε 65 τουλάχιστον διαφορετικούς οργανισμούς και κωδικοποιούν πολυπεπτιδικές αλυσίδες αποτελούμενες από 93-101 αμινοξέα. Η υψηλότατη αμινοξική ομολογία μεταξύ των πρωτεϊνικών αυτών μορίων εισάγει με νέα ορθόλογη οικογένεια πρωτεϊνών, συντηρημένη από τον C. elegans έως τον άνθρωπο, η οποία ονομάστηκε οικογένεια των ριβονουκλεασών κ. Σε ό,τι αφορά στην έκφραση της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ μελέτη των EST αλληλουχιών που προέκυψαν από την αναζήτηση στις διάφορες βάσεις δεδομένων, οδήγησε στην αποκάλυψη ότι η ανθρώπινη RNase κ εκφράζεται σε μια πληθώρα φυσιολογικών και καρκινικών ιστών αλλά και σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Επιπρόσθετα, ανάλυση κατά Northern αποκάλυψε την ύπαρξη ενός κύριου μεταγράψου που εκφράζεται σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν, αλλά και 2 μεγαλύτερων μεταγράφων που εκφράζονται μόνο στον εγκέφαλο, τον πλακούντα και το πάγκρεας. Για την έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ σε βακτηριακά συστήματα δοκιμάστηκε μια σειρά διαφορετικών πλασμιδιακών φορέων, όπως οι pET-15b, pET-20b, pET-29b, pET-cocol και pET-39b. Σε όλες τις περιπτώσεις η επαγωγή της βακτηριακής καλλιέργειας είχε σαν αποτέλεσμα την έντονη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή τοξική δράση της επαγόμενης ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ στα κύτταρα της E. coli. Σε μια προσπάθεια να μειωθεί η κυτταροτοξική δράση, η κωδικοποιούσα περιοχή της ανθρώπινης RNase κ υποκλωνοποιήθηκε στο φορέα pSCREEN l(b)+, όπου η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκφράζεται ως πρωτεΐνη σύντηξης με την κύρια πρωτεΐνη του καψιδίου του βακτηριοφάγου Τ7. Η έκφραση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ στο φορέα αυτό δεν συνοδεύτηκε από φαινόμενα τοξικότητας, γεγονός που είχε σαν αποτέλεσμα την επιτυχή έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Για τον καθαρισμό της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης RNase κ χρησιμοποιήθηκε ένα πρωτόκολλο που περιλαμβάνει χρωματογραφία σε στήλη Ni⁺⁺, πέψη της πρωτεΐνης σύντηξης με θρομβίνη και επαναχρωματογραφία των προϊόντων της πέψης στην ίδια στήλη. Η εφαρμογή του πρωτοκόλλου αυτού είχε σαν αποτέλεσμα την απομόνωση πολύ μικρών ποσοτήτων ισχυρά υδρόφοβης καθαρής ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ, η οποία εμφάνιζε πάρα πολύ χαμηλή ριβονουκλεολυτική ενεργότητα. Για το λόγο αυτό ακολούθησαν προσπάθειες έκφρασης της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης πρωτεΐνης στο ευκαρυωτικό σύστημα του ζυμομύκητα Pichia pastoris. Αρχικά, προκειμένου να εκφραστεί η ανθρώπινη RNase κ το cDNA που την κωδικοποιεί υποκλωνοποιήθηκε στο φορέα έκφρασης pPICZa A, ο οποίος αφού έγινε γραμμικός ενσωματώθηκε στο γονιδίωμα του στελέχους ΚΜ71 του ζυμομύκητα. Ακολούθησε επιλογή των κλώνων που είχαν ενσωματώσει το επιθυμητό cDNA, οι οποίοι υπεβλήθησαν σε επαγωγή της έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Από το σύνολο των κλώνων που εξετάστηκαν ένας κλώνος Βρέθηκε να εκφράζει την ανασυνδυασμένη ανθρώπινη RNase κ σε ικανοποιητική ποσότητα, όπως διαπιστώθηκε από SDS ηλεκτροφόρηση αλλά και από ανάλυση κατά Western. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ριβονουκλεάση κ καθαρίστηκε σε ομογενή μορφή με χρωματογραφία σε στήλη Ni⁺⁺ και η μελέτη της έδειξε ότι παρουσίαζε σημαντική ριβονουκλεολυτική ενεργότητα. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ έδειξε ότι η ανασυνδυασμένη ριβονουκλεάση: • Διασπά κατά σειρά προτίμησης ApU>ApG>UpU φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. • Διασπά το συνθετικό υπόστρωμα poly (U), αλλά και τα φυσικά tonila yeast RNA, 28S και 18S rRNA. • Η ενεργότητα της εξαρτάται ανάλογα από το χρόνο επώασης και τη συγκέντρωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. • Η ενεργότητα της δεν επηρεάζεται από την παρουσία μονοσθενών ιόντων αλλά και των δισθενών ιόντων Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ και Mn⁺⁺, ενώ αναστέλλεται από τα ιόντα Zn⁺⁺, Cu⁺⁺, Hg⁺⁺ και Fe⁺⁺. • Είναι θερμοευαίσθητη και λειτουργεί σε ένα εύρος τιμών pH μεταξύ 5- 8, ενώ παρουσιάζει βέλτιστο pH δράσης 8. • Η ριβονουκλεολυτική της ενεργότητα αναστέλλεται πλήρως παρουσία του αναγωγικού παράγοντα DTT, ενώ οι αλκυλιωτικοί παράγοντες ΝΕΜ και ιοδοακεταμίδιο δεν επηρεάζουν την ενζυμική ενεργότητα. • Τέλος, η ενεργότητα του ενζύμου δεν αναστέλλεται από τον placental RNase inhibitor, τον πιο σημαντικό αναστολέα των ριβονουκλεασών της υπεροικογένειας Α. Συνοψίζοντας, η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης κ, ως το δεύτερο μέλος της οικογένειας των ριβονουκλεασών κ, εδραιώνει την αναγνώριση της καινούριας αυτής πρωτεϊνικής οικογένειας στα μετάζωα. Η νουκλεοτιδική εξειδίκευση της ανθρώπινης RNase κ, η απουσία οποιασδήποτε ομολογίας με τις ριβονουκλεάσες της υπεροικογένειας A και η αδυναμία αναστολής της ριβονουκλεολυτικής της ενεργότητας από τον αναστολέα των ριβονουκλεασών (RI) ουσιαστικά αποδεικνύουν την ανυπαρξία οποιασδήποτε εξελικτικής συγγένειας των ριβονουκλεασών της υπεροικογένειας A και της οικογένειας κ. Τα πολύ υψηλά ποσοστά συντηρητικότητας που παρουσιάζουν οι ριβονουκλεάσες της οικογένειας κ σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η ανθρώπινη RNase κ έχει βρεθεί να εκφράζεται σε όλους σχεδόν τους ανθρώπινους ιστούς αλλά και σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια υποδεικνύουν ένα σημαντικό βιολογικό ρόλο για τα μέλη αυτής οικογένειας ριβονουκλεασών.