Έκφραση των γονιδίων bcl-2, mdm-2, p53 και του δείκτη απόπτωσης σε νεοπλάσματα του παχέος εντέρου

Abstract

Aim: The aims of the MD Thesis were: a) to evaluate the presence of apoptosis and the bcl-2, p53, mdm2 protein expression in colorectal adenomas and carcinomas, (b) to correlate the above mentioned immunomarkers and apoptosis with clinicopathological parameters and patients' survival, using image analysis. Methods: Formalin-fixed paraffin-embedded tissue from 121 cases of colon adenomas and 46 colorectal carcinomas was stained by immunohistochemistry for bcl-2, p53 and mdm-2 protein, according to the Avidin-Biotin Complex method. Biopsies from endoscopically normal mucosa of 25 consecutive patients, who underwent colonoscopy for non-neoplastic, non-inflammatory disorders, were also stained for the above proteins and were used as controls. Apoptosis was measured by TUNEL method. The number of the positive stained cells was counted by using image analysis technique. Results: Bcl-2 cytoplasmic staining was found in 114/121 (96%) adenomas and in 18/46 (39%) colorectal carcinomas. P53 nuclear staining was found in 97/121 (80%) adenomas and in 19/46 (41%) colorectal carcinomas. Mdm-2 nuclear staining was found in 78/121 (78%) adenomas and in 25/46 (57%) colorectal carcinomas. Apoptotic index was higher in adenomas (p=0.012) in relation to carcinomas (p=0.006) and normal colonic mucosa (p=0.006). P53 and bcl-2 protein expression was higher in tubulovillous-villous adenomas (p=0.03 and p=0.02, respectively) and in adenomas with size ≥1cm (p=0.006 and p=0.03, respectively). A statistically significant relationship between bcl-2 expression and the degree of dysplasia was observed (p=0.009). In multivariate analysis, patients with ≥2 distal adenomas were more likely to have proximal neoplasms (p=0.049) and even more advanced proximal neoplasms (p=0.020). In carcinomas an inverse relationship between p53 and bcl-2 was found (p=0.035). In Cox regression analysis, Dukes' stage was the most significant independent prognostic indicator of a worse survival (p<0.019), whereas when stage was eliminated, bcl-2 expression was also a potential predictor for poor prognosis (p=0.02). Conclusions: In conclusion, p53 and bcl-2 oncogenes probably regulate a common cell death pathway interacting through opposite mechanisms in the regulation of apoptosis. Bcl-2 and mdm-2 expression seems to occur in the early stage of colorectal carcinogenesis. In large adenomas bcl-2 overexpression, in addition to increased p53 expression, reduces apoptosis and give them a potential malignant phenotype. In carcinomas, apart from Dukes' stage, the bcl-2 expression seems to be an independent prognostic factor associated with an unfavourable outcome. Finally, in the current study, patients with ≥2 distal adenomas were more likely to have proximal neoplasms and even more proximal advanced neoplasms.

Σκοπός: 0 σκοπός της διατριβής ήταν α) να μελετήσει τον ρυθμό απόπτωσης και την ανοσοϊστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών p53, bcl-2, mdm-2 και την πιθανή συνέκφραση αυτών σε φυσιολογικό βλεννογόνο, σε αδενώματα και σε αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου και β) να διερευνήσει πιθανές συσχετίσεις των ανωτέρω παραγόντων με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους και με την επιβίωση των ασθενών, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανάλυσης εικόνας. Υλικό - Μέθοδοι: Μελετήθηκαν 46 αδενοκαρκινώματα και 121 αδενώματα καθώς και βιοψίες από φυσιολογικό βλεννογόνο σε 25 υγιείς μάρτυρες. Η έκφραση των πρωτεϊνών bcl-2, p53 και mdm-2 μελετήθηκαν ανοσοϊστοχημικά, σύμφωνα με τη μέθοδο Αβιδίνης-Βιοτίνης. Η απόπτωση μελετήθηκε με τη μέθοδο TUNEL. Το ποσοστό των θετικά χρωματισμένων κυττάρων μετρήθηκε με τεχνική ανάλυσης εικόνας. Αποτελέσματα: Κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης bcl-2 παρατηρήθηκε σε 114/121 (96%) αδενώματα και σε 18/46 (39%) ΚΠΕ. Πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης p53 παρατηρήθηκε σε 97/121 (80%) αδενώματα και σε 19/46 (41%) ΚΠΕ. Πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης mdm-2 παρατηρήθηκε σε 78/121 (78%) αδενώματα και σε 25/46 (57%) ΚΠΕ. Οι τιμές του ΑΙ στο φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου ήταν σημαντικά μικρότερες από αυτές στο επιθήλιο των αδενωμάτων (p=0.006). Ο αποπτωτικός δείκτης (ΑΙ) ήταν μεγαλύτερος στα αδενώματα (p=0.012) σε σχέση με τα ΚΠΕ (p=0.006). Η έκφραση της πρωτεΐνης p53 και bcl-2 ήταν μεγαλύτερη στα σωληνολαχνωτά-λαχνωτά αδενώματα (p=0.03 και p=0.02, αντίστοιχα) και στα αδενώματα ≥1cm (p=0.006 και p=0.03, αντίστοιχα). Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης bcl-2 και του βαθμού δυσπλασίας (p=0.009). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση επίσης, οι ασθενείς με ≥2 άπω αδενώματα είχαν στατιστικά μεγαλύτερη πιθανότητα να εμφανίζουν εγγύς νεόπλασμα (p=0.049) και ιδιαίτερα εγγύς «σοβαρό» νεόπλασμα (p=0.020). Στα ΚΠΕ η έκφραση της πρωτεΐνης p53 παρουσίασε αντίστροφη συσχέτιση με την έκφραση της πρωτεΐνης bcl-2 (rho=-0.312, p=0.035). Στην Cox regression ανάλυση, το στάδιο Dukes (p<0.019) αναδείχθηκε ως ο μόνος σημαντικός ανεξάρτητος αρνητικός προγνωστικός παράγοντας, για την επιβίωση των ασθενών (p=0.008). Όταν όμως από το μοντέλο αφαιρέθηκε το στάδιο, προέκυψε η έκφραση της πρωτεΐνης bcl-2, ως σημαντικός αρνητικός παράγοντας επιβίωσης (p=0.02). Συμπερασματικά: Τα ογκογονίδια p53 και bcl-2 ρυθμίζουν ενδεχομένως μία κοινή οδό κυτταρικού θανάτου και αλληλεπιδρούν μέσω αντίθετων μηχανισμών στη ρύθμιση της απόπτωσης. Η υπερέκφραση των πρωτεϊνών bcl-2 και mdm-2 συμβαίνει στα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης ενώ η έκφραση της bcl-2 φαίνεται να προηγείται των γενετικών μεταβολών του p53. Στα μεγάλα αδενώματα, η υπερέκφραση της bcl-2 παράλληλα με την αυξημένη έκφραση της p53 πρωτεΐνης, ελαττώνουν το ρυθμό της απόπτωσης προσδίδοντας τους ένα δυνητικά κακοήθη φαινότυπο. Επίσης, οι ασθενείς με ≥2 άπω αδενώματα έχουν στατιστικά μεγαλύτερη πιθανότητα να εμφανίζουν εγγύς νεόπλασμα και ιδιαίτερα εγγύς «σοβαρό» νεόπλασμα. Στα ΚΠΕ, φαίνεται ότι και η έκφραση της bcl-2 πρωτεΐνης, εκτός από το στάδιο Dukes, αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα δυσμενούς πρόγνωσης.