Σύνθεση και μελέτη νέων βιοδραστικών λιπιδίων

Abstract

Lipases constitute a diverse and ubiquitous family of enzymes that catalyze the hydrolysis of triacylglycerols (TAGs) and find attractive applications in biotechnology. In humans the digestion of dietary TAGs requires the successive intervention of two lipases, human pancreatic (HPL) and gastric (HGL) lipase. The conversion of TAGs into monoacylglycerols and free fatty acids, a necessary step for efficient fat digestion and absorption by enterocytes, starts in the stomach, where HGL is secreted, and is completed by HPL in the small intestine, where absorption of lipolytic products occurs. Therefore, inhibitors of digestive lipases are of special interest because they may find applications as anti-obesity agents. A gastrointestinal lipase inhibitor of microbial origin, tetrahydrolipstatin (OrlistatO), a b-lactone-containing inhibitor, is now a registered drug for weight reduction. The active site of HPL and HGL contains Ser-His-Asp residues, as it has been proven by crystallographic data. The catalytic triad is homologous to that described for serine proteases. Synthetic inhibitors of lipases have been used in the study of structural and mechanistic properties of lipases. The phospholipases A2 (PLA2) superfamily consists of a broad range of enzymes defined by their ability to catalyze the hydrolysis of the ester bond at the sn-2 position of phospholipids. Among the various PLA2s, human cytosolic PLA2, (cPLA2) plays a central role in lipid mediator biosynthesis. Mice made deficient in cPLA2 showed a marked decrease in eicosanoid biosynthesis, allergic symptoms and postischemic brain injury. cPLA2 is essential for pro-inflammatory prostaglandin, leukotriene and PAF production, and therefore its inhibitors are very attractive targets as agents to treat inflammatory and other diseases. Several inhibitors of cPLA2 have been reported including arachidonyltrifluoromethylketone, methyl arachidonyl fluorophosphonate, fatty acid tricarbonyls, pyrrolidine-based inhibitors. The catalytic mechanism of cPLA2 proceeds through a serine-acyl intermediate using Ser-228 as the nucleophilic residue. The enzyme possesses an unusual catalytic Ser-Asp dyad located in a deep cleft at the center of a hydrophobic funnel. The aim of this thesis was the design of novel inhibitors of human digestive lipases and human cPLA2, the development of a general methodology for the synthesis of the target compounds and the study of the inhibitory potency of the new molecules against the above mentioned lipolytic enzymes. In general a lipase inhibitor should consist of two components: a chemically reactive moiety, capable of reacting with the active site serine of the enzyme and a part that contains chemical motifs, necessary for specific interactions and a proper orientation in the enzyme binding pocket. The design of the new inhibitors was based on the homology of lipases active site to that of serine proteases. A key mechanistic feature of many serine protease inhibitors is the presence of an activated carbonyl group replacing the scissile amide bond. Peptidyl trifluoromethyl ketones have been reported to inhibit various serine proteases and some of them have entered clinical trials. Peptide aldehydes have been reported to inhibit serine and cysteine proteases. It should be noted that two tripeptide aldehyde inhibitors of thrombin have entered clinical trials. We have recently demonstrated that lipophilic 2-oxo amides and 2-oxo amide triacylglycerol analogues are effective inhibitors of digestive lipases. To develop potent and specific inhibitors of lipases, we chose the 2-oxo amide, aldehyde and trifluoromethyl ketone functionalities, which are potential sites for nucleophilic attack by the active site serine. We have designed inhibitors that contained the above mentioned functionalities in a triacylglycerol backbone.........................................................................................................................

Οι λιπάσες αποτελούν μια οικογένεια ενζύμων που καταλύουν την υδρόλυση τριακυλογλυκερολών (ΤAGs) και βρίσκουν σημαντικές εφαρμογές στη βιοτεχνολογία. Στους ανθρώπους, η πέψη των λιπών της τροφής απαιτεί τη συνεργιστική δράση της ανθρώπινης παγκρεατικής λιπάσης (HPL) και της γαστρικής λιπασής (HGL). Η μετατροπή των TAGs σε μονοακυλογλυκερόλες και ελεύθερα λιπαρά οξέα, ένα βήμα απαραίτητο για την πέψη και απορρόφηση του λίπους της τροφής, ξεκινά στο στομάχι, όπου εκκρίνεται η HGL και ολοκληρώνεται από την HPL στο λεπτό έντερο, όπου λαμβάνει χώρα και η απορρόφηση των προϊόντων της λιπόλυσης. Οι αναστολείς των λιπασών της πέψης, λοιπόν, παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον γιατί μπορούν να βρουν εφαρμογή ως παράγοντες για την καταπολέμηση της παχυσαρκίας. Η τετραϋδρολιπστατίνη, ένας αναστολέας λιπασών που περιέχει δακτύλιο b-λακτόνης, είναι ένα αποτελεσματικό φάρμακο κατά της παχυσαρκίας, που κυκλοφορεί στο εμπόριο. Έχει αποδειχθεί από κρυσταλλογραφικά δεδομένα ότι το ενεργό κέντρο των HPL, HGL αποτελείται από την καταλυτική τριάδα Ser-His-Asp, η οποία είναι ομόλογη προς αυτή των σερινοπρωτεασών. Συνθετικοί αναστολείς των λιπασών έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη δομικών και μηχανιστικών χαρακτηριστικών των λιπασών. Οι υπεροικογένεια των φωσφολιπασών Α2 (PLA2) αποτελείται από μεγάλο αριθμό ενζύμων που προσδιορίζονται από την ικανότητά τους να καταλύουν την υδρόλυση του εστερικού δεσμού της θέσης sn-2 φωσφολιπιδίων. Ανάμεσα στις διάφορες PLA2s η ανθρώπινη κυτοσολική PLA2 (cPLA2) έχει σημαντικό ρόλο στη βιοσύνθεση λιπιδικών αγγελιοφόρων. Η cPLA2 είναι απαραίτητη για την παραγωγή προσταγλανδινών, λευκοτριενίων και PAF, συνεπώς οι αναστολείς αυτού του ενζύμου αποτελούν ελκυστικούς στόχους ως παράγοντες αντιμετώπισης φλεγμονών και άλλων ασθενειών. Διάφοροι αναστολείς της cPLA2 έχουν αναφερθεί όπως αραχιδονυλοτριφθορομεθυλοκετόνη, τρικαρβονυλικές ενώσεις, αναστολείς τύπου πυρρολιδίνης. Το ένζυμο κατέχει μια ασυνήθιστη καταλυτική δυάδα Ser-Asp και ο καταλυτικός μηχανισμός της cPLA2 χωρεί μέσω ενδιαμέσου ακυλιωμένης σερίνης. Ο σκοπός αυτής της διατριβής ήταν ο σχεδιασμός νέου τύπου αναστολέων των λιπασών της πέψης και της cPLA2, η ανάπτυξη μεθόδων σύνθεσης των ενώσεων στόχων και η μελέτη της ανασταλτικής ισχύος των νέων μορίων έναντι των λιπολυτικών ενζύμων που προαναφέρθηκαν. Γενικά, ένας αναστολέας λιπασών θα πρέπει να αποτελείται από μια χημικά δραστική ομάδα, ικανή να αντιδρά με τη σερίνη του ενεργού κέντρου, ενσωματωμένη σε σκελετό που να ομοιάζει προς το υπόστρωμα, ώστε να εξασφαλίζονται οι δευτεροταγείς αλληλεπιδράσεις. Ο σχεδιασμός των νέων αναστολέων στηρίχτηκε στην ομολογία του ενεργού κέντρου των λιπασών προς αυτό των σερινοπρωτεασών. Ένα σημαντικό στοιχείο πολλών αναστολέων σερινοπρωτεασών είναι η ύπαρξη ενεργοποιημένου καρβονυλίου που αντικαθιστά τον υδρολυόμενο αμιδικό δεσμό. Έχει αναφερθεί ότι πεπτιδικές τριφθορομεθυλοκετόνες αναστέλλουν διάφορες σερινοπρωτεάσες και μερικές από αυτές βρίσκονται σε στάδιο σε κλινικών δοκιμών. Πεπτιδικές αλδεΰδες αναστέλλουν σερινο- και κυστεϊνοπρωτεάσες. ........................................................................