Η συμμετοχή των πρωτεϊνών θερμικού σοκ στον μετασχηματισμό και την πυρηνική μετατόπιση του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών

Abstract

Comparison of receptor protein and hormone binding levels in extracts from WCL2 cells, revealed thepresence of non-hormone binding receptor forms, shown by immunoblottmg to contain hsp70, Hop andHip Further analysis of these forms by immunoblottmg of two dimensional SDS-PAGE of cross-linkedGR showed that they are large heterocomplexes (MW>460 kDa), containing as well hsp90 Incubationof these heterocomplexes with RRL resulted in partial reconstitution of the competent GR complex,suggesting that they represent intermediates in the process of constant receptor cycling Moreover,treatment of WCL2 extracts with DNA-cellulose revealed the presence of two separate receptorintermediates, allowing the suggestion of a theoretical model of the receptor constant cycling Toexplore the role of hsp90 and hsp70 in receptor degradation, the effects of heat shock andgeldanamycm on the activity and the structural integrity of receptor molecule were examined While asevere shock resulted in the loss of almost 50% of the receptor in naive WCL2 cells, in heatconditioned cells there was an increase in the amount of the receptor rescued from degradation thatcorrelated with the amount of hsp70 and hsp90, leading us to propose a protective role for the twochaperones in receptor degradation by heat shock In addition, using the proteasome inhibitor ALLN,we were able to analyze the receptor complexes with hsp70 and hsp90 that present the receptor fordegradation in geldanamycm treated cells The data indicate that the type of receptor interaction(dynamic or static) with hsp70 plays a key role in determining its fate, with respect to refolding ordisposal by degradation Finally, using a constitutively active receptor mutant, we found that the overexpressed wild type receptor was capable of repressing mutant activated transcription in a DBDdependent manner, while it had no effect on AP-1 activated transcription

Προκειμένου να προσδιορισθεί ο ρόλος των πρωτεϊνών θερμικού σοκ στο μετασχηματισμότου υποδοχέα από ανενεργό σε ορμονικά ελεγχόμενο μεταγραφικό παράγοντα, μελετήθηκανκυτταρικά συστήματα μόνιμης και παροδικής υπερέκφρασής του, καθώς σε αυτά θεωρήθηκεπιθανή η παρουσία του υπό τη μορφή ενδιάμεσων συμπλοκών της πορείας ανασύστασης τηςμεταγραφικά ικανής μορφής του. Μελέτη του υπερεκφραζόμενου υποδοχέα έδειξε ότι ένασημαντικό κλάσμα του (~ 51%) δεν εμφανίζει ικανότητα σύνδεσης ορμόνης, ενώσυναπομονώνονται με αυτόν οι πρωτείνες hsp70, Hop και Hip. Εφαρμογή της τεχνικής τηςχημικής σύνδεσης των πρωτεϊνικών υπομονάδων των συμπλοκών και ανάλυση μεηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων, έδειξε ότι πρόκειται για σύμπλοκα με MB>460kDa, σταοποία συμμετέχει και η hsp90, και που κατόπιν επωάσεως με λύμα δικτυοερυθροκυττάρωνκουνελιού, μετατρέπονται στην ικανή μορφή. Χρήση DNA ακινητοποιημένου σε κυτταρίνηεπέτρεψε το διαχωρισμό των συμπλοκών του ανενεργού υποδοχέα σε ενδιάμεσα (άμεσηαλληλεπίδραση με την hsp90) και σε πρώιμα (άμεση αλληλεπίδραση με την hsp70)σύμπλοκα, ικανά να δράσουν ως τροποποιητές της μεταγραφής μέσω ειδικών αλληλουχιώνDNA. Επιπλέον, μελέτη της επίδρασης που ασκούν στην αποικοδόμηση του υποδοχέα τοθερμικό σοκ και η κατεργασία με γελνταναμυκίνη, αφενός υπέδειξε την επαγωγή των hsp90και hsp70 ως υπεύθυνη για την προστασία του θερμικά μετουσιωμένου υποδοχέα απόαποικοδόμηση, και αφετέρου μας οδήγησε να υποστηρίξουμε ότι η φύση της αλληλεπίδρασηςτου με την hsp70 είναι καθοριστικής σημασίας για το αν θα προαχθεί η ανασύσταση ή ηαποικοδόμηση του.