Μελέτη κυτταροκινών σε κλινικά μοντέλα φλεγμονής - διευκρίνιση της βιολογικής σχέσης μεταξύ ουδετερόφιλων και ιστικού παράγοντα

Abstract

Background: It is well known that polymorphonuclear cells (PMN) and the complement system represent two of the main sentinels of the innate immune response and that they are crucial mediators of acute inflammation. Recent studies suggest a link between inflammation and thrombosis, raising serious and controversial discussions. Tissue factor (TF) is the primary in vivo initiator of coagulation and also seems to play an important role in inflammation according to recent studies in patients with sepsis and disseminated intravascular coagulation (DIC). The major blood cell population in which TF was detected during sepsis was blood monocytes. Objective: As it is widely known that PMN accumulate at the sites of inflammation is PMN. In the present study we focused on the ability of PMN to produce functional ΤF thus triggering the coagulation cascade and furthermore the role of complement - an essential component of the innate immunity - in this interplay. In this context we used the antiphospholipid syndrome (APS), as a well studied model of auto-antigen induced thrombosis. Patients and Methods: Stimulation and inhibition studies were performed in PMN to reveal TF induction. PMN from 22 healthy donors were incubated with serum from 11 patients with APS (6 with primary and 5 with secondary APS). PMN were also stimulated with recombinant C5a. Complement blockade in PMN was performed using complement inhibitor compstatin and a selective C5aR antagonist. TF expression from these studies was examined in functional, mRNA and protein level. Results: PMN incubation with APS serum led to expression of functional TF. This upstream regulation of TF expression in PMN coincides with the increased procoagulant activity detected by the mPT assay and the TF specificity was confirmed by the use of an anti-TF mAb. The same findings were confirmed at TF mRNA level (RT-PCR), as well as in protein level showed by immunocytochemical staining, FACS and Western blot analysis. The use of a specific complement inhibitor compstatin revealed that the activation of the complement system is triggered by APS IgG, leading to the induction of TF depended procoagulant activity. This activity is abolished in cells pretreated with an inhibitor of C5aR, implicating thus the role of C5a in this process. This finding was reconfirmed using rhC5a to stimulate PMN that also lead to TF expression... These results demonstrated that C5a and its receptor mediate the triggering of TF expression in PMN after stimulation with APS serum. Conclusion: Our results verify a new pathway of interplay between PMN, complement and coagulation. Our findings could represent a novel scientific basis for alternative therapeutical approaches against APS and complement -associated thrombotic diseases.

Tα ουδετερόφιλα και το συμπλήρωμα κατέχουν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη της φυσικής ανοσίας και ταυτόχρονα δρουν και σαν διαμεσολαβητές για την εξέλιξη της οξείας φλεγμονής. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν συσχέτιση μεταξύ φλεγμονής και θρόμβωσης, με τα αποτελέσματά τους να εγείρουν έντονες αντικρουόμενες συζητήσεις. Ο ιστικός παράγοντας (ΤF) είναι ο βασικός in vivo πυροδοτητής του καταρράκτη της πήξης, ενώ αναδύεται ο σημαντικός του ρόλος στην φλεγμονή από μελέτες που έγιναν σε ασθενείς με σήψη και διάχυτη ενδαγγεακή πήξη (ΔΕΠ). Ο κύριος κυτταρικός πληθυσμός του αίματος στον οποίο έχει παρατηρηθεί μέχρι σήμερα η έκφρασή του ιστικού παράγοντα κατά τη διάρκεια της σήψης είναι τα μονοκύτταρα. Είναι γνωστό ότι ο μεγαλύτερος πληθυσμός κυττάρων που συσσωρεύεται στα σημεία της φλεγμονής είναι αυτός των πολυμορφοπύρηνων. Παρακινούμενοι από τα ασαφή ευρήματα για την ικανότητα των ουδετεροφίλων να παράγουν ιστικό παράγοντα και να συμμετέχουν στη θρόμβωση, καθώς και για το ρόλο του συμπληρώματος - βασικού συστατικού της φυσικής ανοσίας- στην παραγωγή ιστικού παράγοντα εξετάσθηκε η ικανότητα των ουδετεροφίλων να παράγουν TF καθώς και ο ρόλος του συμπληρώματος στην διέγερση της θρόμβωσης. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα καλά μελετημένο μοντέλο θρομβωτικής νόσου επαγόμενης μέσω αυτοαντισωμάτων, το σύνδρομο αντιφωσφολιπιδίων - antiphospholipid syndrome (ΑPS). Πολυμορφοπύρηνα (PMN) από 22 υγιείς εθελοντές επωάσθηκαν με ορό 11 ασθενών με ΑPS (6 με πρωτοπαθές και 5 με δευτεροπαθές APS) και η παραγωγή ιστικού παράγοντα μελετήθηκε σε λειτουργικό επίπεδο ,σε mRNA και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Η διέγερση των PMN με ορό ασθενών με APS οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή TF. Η έκφραση του TF από τα ουδετερόφιλα συσχετίζεται με αυξημένη πηκτική δραστηριότητα, όπως επιβεβαιώνεται από τον τροποποιημένο χρόνο προθρομβίνης (modified PT-mPT) ο οποίος επανέρχεται στα φυσιολογικά επίπεδα μετά από τη χρήση αντι-ΤF μονοκλωνικού αντισώματος. Tα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν τόσο σε RNA (RT-PCR) όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, (ανοσοϊστοχημεία και western blot). Η χρήση του αναστολέα του συμπληρώματος compstatin έδειξε ότι η ενεργοποίηση του συμπληρώματος διεγείρεται από τις ανοσοσφαιρίνες IgG του APS και προάγει την TF εξαρτώμενη πηκτική διαδικασία. Πειράματα αναστολής σε ουδετερόφιλα με τη χρήση του εκλεκτικού ανταγωνιστή του υποδοχέα C5aR και διέγερσή τους με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο C5a έδειξε τη συμμετοχή των δυο αυτών στοιχείων του συμπληρώματος στην επαγωγή της έκφρασης του TF αυξάνοντας τις θρομβωτικές ιδιότητες των διεγερμένων με ορό APS ουδετεροφίλων. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα της ύπαρξης μίας νέας οδού διασύνδεσης μεταξύ των ουδετεροφίλων, του συμπληρώματος και της θρόμβωσης. Τα ευρήματα αυτά θα μπορούσαν να αποτελέσουν ερευνητική βάση για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις τόσο για το ΑPS τόσο και άλλες εξαρτώμενες από το συμπλήρωμα θρομβωτικές νόσους.