Μελέτη αντιγόνων mage για την ανάπτυξη αντικαρκινικών εμβολίων

Abstract

A peptide anticancer vaccine is a valuable tool in inducing anticancer T cell response as they can harm cancer cells without destroying normal tissues. On the other hand anticancer vaccines are well characterized and can be produced in high quantities and purity. T cells play an important role in controlling tumor growth and mediating tumor regression. Anti-cancer responses, as well as CD4 and CD8 epitopes of tumor antigens, have been detected in many patients, although these responses are not accompanied by tumor regression. On the other hand, human and animal studies have shown that the combined application of class I and class ll epitopes, derived from the same tumor antigen, promotes the quality of the immune response and generates long term immunity. MAGE antigens are cancer/testis antigens (expressed in tumors but silent in normal cells except for male germ line cells), shared by many tumors. These genes are of particular interest for cancer immunotherapy. Among the MAGE genes, MAGE 3 is one of the most frequently expressed in tumors (in 76% of metastatic melanomas). There have been various efforts to detect CTL responses to MAGE 3 and MHC-I restricted CTL epitopes have been identified. Nowadays, the improved methods of peptide synthesis have allowed a greater availability of peptides in immunochemistry. To obtain potent antigens and-or effective immunogens, synthetic peptides (epitopes) have to be conjugated to a carrier molecule, either to a protein such as bovine serum albumin, either to a synthetic carrier. A new peptide carrier has been developed in our laboratory, named Sequential Oligopeptide Carriers I and II, SOCn-I and SOCn-II. The SOCn-I carrier is constructed by the repetitive moiety Lys-Aib-Gly and the SOCn-II carrier by the repetitive tetrapeptide Aib-Lys-Aib-Gly. Both carriers adopt 3₁₀-helical conformation and the Lys-NᵋΗ₂ groups exhibit defined spatial orientations, so that the attached antigenic peptides do not interact with each other or with the carrier molecule. Thus, the structure regularity of the carrier, the absence of conformational restrictions and steric hindrances for the constructed conjugates favour an optimal antibody recognition and generate potent immunogens. CD8 epitopes derived from MAGE 3 cancer antigens were anchored to the SOCn (I,II) carrier in order to improve their antigenic/immunogenic properties. Conformational studies by circular dichroism spectroscopy (CD) suggested the occurrence of well defined structures in aqueous and miceller microenvironment. Fluoresceine was covalently coupled to the SOCn-conjugates to confirm their membrane insertion by confocal microscopy. Biological studies in PMBC cells and dendritic cells, by FACS analysis, pointed out CD8⁺ T cell activation, production ofIFN-γ (ELISA assays), whereas IL-4 was not detected. The reported findings evidence the generation of Thl cytotoxic immune response derived from the SOCn-conjugates, which may lead to the development of protective immunity in anticancer vaccines.

Η χρησιμοποίηση πεπτιδικών εμβολίων με σκοπό την επαγωγή αντικαρκινικής Τ-κυτταρικής απόκρισης πλεονεκτεί ως προς το ότι είναι δυνατόν να επιτευχθεί η καταστροφή των καρκινικών κυττάρων χωρίς να επηρεαστούν οι φυσιολογικοί ιστοί. Επίσης, η παρασκευή και ο χαρακτηρισμός τους είναι σχετικά εύκολος και όπως φαίνεται από κλινικές μελέτες που έγιναν τα εμβόλια αυτά είναι ασφαλή. Η συνύπαρξη τάξης I και τάξης II επιτόπων που προέρχονται από το ίδιο καρκινικό αντιγόνο έχει βρεθεί ότι ενισχύει την ποιότητα της ανοσολογικής απόκρισης, προκαλεί μακράς διάρκειας ανοσία και ενδυναμώνει την αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι τα CD4 Τ κύτταρα ενεργοποιούν τα αντιγονοπαρουσιαστικά (δενδριτικά) κύτταρα μέσω αλληλεπίδρασης των CD40 και των προσδετών τους και με τη σειρά τους τα ενεργοποιημένα δενδριτικά κύτταρα μπορούν να παρουσιάσουν το αντιγόνο στα CD8 Τ κύτταρα. Το MAGE 3 καρκινικό αντιγόνο αποτελεί ένα από τα περισσότερο μελετημένα καρκινικά αντιγόνα. Το αντιγόνο αυτό ανήκει στην κατηγορία των εξειδικευμένων αντιγόνων και εκφράζεται σε μεγάλο ποσοστό στο μελάνωμα. Επίσης, εκφράζεται και σε άλλα είδη καρκίνου όπως είναι ο καρκίνος του στήθους, των πνευμόνων, του θυρεοειδούς αδένα και του εντέρου. Τα μόνα φυσιολογικά κύτταρα στα οποία εκφράζεται το MAGE 3 είναι οι πλακούντιοι τροφοβλάστες και τα ορχικά γενετικά κύτταρα, στα οποία δεν εκφράζονται τα μόρια MHC. Για την παρασκευή ισχυρών ανοσογόνων/αντιγόνων χρησιμοποιείται η τεχνική της πρόσδεσης των επιτόπων σε πρωτεϊνικούς φορείς. Στο εργαστήριο Πεπτιδοχημείας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων σχεδιάστηκε και παρασκευάστηκε ένα συνθετικό υπόστρωμα με δομική σταθερότητα και κανονικότητα, έτσι ώστε οι πεπτιδικοί επίτοποι να προσδένονται χωρίς διαμορφωτικούς περιορισμούς ή στερικές παρεμποδίσεις. Το παρασκεύασμα αυτό είναι ο Επαναλαμβανόμενος Ολιγοπεπτιδικός Φορέας τύπου I ή τύπου II (Sequential Oligopeptide Carrier -I, ΙΙ, SOCn I, II). O SOCn I αποτελείται από την επαναλαμβανόμενη ακολουθία αμινοξέων Lys-Aib-Gly, ενώ ο SOCn II αποτελείται από την επαναλαμβανόμενη ακολουθία αμινοξέων Aib-Lys-Aib-Gly. Η παρούσα εργασία αναφέρεται στη σύνθεση, τη διαμορφωτική μελέτη με την τεχνική του κυκλικού διχρωϊσμού και τη μελέτη της διαμεμβρανικής μεταφοράς πεπτιδικών φορέων πολλαπλών αντιγονικών ή/και ανοσογονικών επιτόπων με τη συνεστιακή μικροσκοπία. Η εργασία περιλαμβάνει επίσης βιολογικά πειράματα (FACS ανάλυση και ELISA) για τη μελέτη της ενεργοποίησης Τ κυττάρων με αυτόλογα δενδριτικά κύτταρα που έχουν προεπωασθεί με τα SOCn-παράγωγα. Η εργασία περιλαμβάνει δύο τμήματα: το πρώτο (Κεφάλαια 1-9) είναι το θεωρητικό, ενώ το δεύτερο (Κεφάλαιο 10-19) είναι το πειραματικό μέρος, στο οποίο παρατίθενται η σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων και μακρομορίων, τα αποτελέσματα της μελέτης της διαμόρφωσης, τα αποτελέσματα της διαμεμβρανικής μεταφοράς των πεπτιδίων και τα αποτελέσματα των βιολογικών αποτελεσμάτων. Στο Κεφάλαιο 1 γίνεται αναφορά στη μοριακή βάση της ανοσίας, δηλαδή στην ικανότητα του οργανισμού να αμύνεται στην επίδραση διαφόρων αντιγόνων. Το κεφάλαιο αυτό αναφέρεται στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος και στην ανοσολογική απόκριση που επάγεται από την ενεργοποίησή τους. Επισημαίνεται η σημαντικότητα του καθορισμού πολλών αντιγόνων καρκινικών κυττάρων που αναγνωρίζονται από Τ κύτταρα και συγκεκριμένα του καρκινικού αντιγόνου MAGE 3. Επίσης, γίνεται αναφορά στην ασθένεια του καρκίνου και στην καταπολέμηση αυτού μέσω του ανοσοποιητικού συστήματος, καθώς επίσης και στα αντικαρκινικά πεπτιδικά εμβόλια. Στο Κεφάλαιο 2 περιγράφονται οι μέθοδοι ενίσχυσης της αντιγονικότητας/ανοσογονικότητας των πεπτιδίων. Ιδιαίτερη αναφορά γίνεται στη χρήση συνθετικών φορέων και πιο συγκεκριμένα στους Επαναλαμβανόμενους Ολιγοπεπτιδικούς Φορείς SOCn, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να ελεγχθεί η ενίσχυση της αντιγονικότητας/ανοσογονικότητας των επιτόπων. Το Κεφάλαιο 3 αναφέρεται στην πεπτιδική σύνθεση και πιο συγκεκριμένα δίνεται λεπτομερής ιστορική αναδρομή στα αντιδραστήρια σύζευξης που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδοχημεία. Επίσης, υπάρχει αναλυτική παρουσίαση των πολυμερικών υποστρωμάτων και των αμινοπροστατευτικών ομάδων που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση. Στο Κεφάλαιο 4 περιγράφονται οι μέθοδοι ταυτοποίησης και καθαρισμού πεπτιδίων. Συγκεκριμένα, περιγράφονται η αρχή μεθόδου της διαπίδυσης, της υγρής χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης και υψηλής διαχωριστικής ικανότητας και της φασματοσκοπίας μάζας ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό. Το Κεφάλαιο 5 αφορά την τεχνική που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία για τη διαμορφωτική ανάλυση των πεπτιδίων/μακρομορίων. Συγκεκριμένα, παρουσιάζονται αναλυτικά οι βασικές αρχές της φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωϊσμού και ο τρόπος μελέτης της δευτεροταγούς διαμόρφωσης των πεπτιδίων σε διάλυμα. Στο Κεφάλαιο 6 περιγράφονται συνοπτικά οι βασικές αρχές της συνεστιακής μικροσκοπίας (Confocal Microscopy), η οργανολογία που χρησιμοποιείται και τα πλεονεκτήματα της μεθόδου που την καθιστούν ως την πλέον διαδεδομένη τεχνική μελέτης τόσο «ζωντανών» αλλά και μονιμοποιημένων «fixed» συστημάτων. Το Κεφάλαιο 7 αναφέρεται στην κυτταρομετρία ροής. Συγκεκριμένα περιγράφονται συνοπτικά οι βασικές αρχές της κυτταρομετρίας ροής και η οργανολογία που χρησιμοποιείται, καθώς επίσης και οι συνηθέστεροι τρόποι παρουσίασης των αποτελεσμάτων που προκύπτουν. Στο Κεφάλαιο 8 περιγράφονται οι βασικές αρχές της ανοσοενζυμικής τεχνικής για την ανίχνευση αντισώματος ή αντιγόνου, η γνωστή τεχνική ELISA. Στο Κεφάλαιο 9 αναφέρεται ο σκοπός της παρούσας εργασίας. Στο Κεφάλαιο 10 περιγράφεται αναλυτικά η διαδικασία που ακολουθήθηκε κατά τη σύνθεση των πεπτιδίων της παρούσας εργασίας με την τεχνική της πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση κατά Merrifield καθώς και ο τρόπος που έγινε η ομοιοπολική σύνδεση της φλουορεσκεΐνης στα πεπτίδια σε υγρή φάση. Ακόμη, παρατίθενται τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν. Τέλος περιγράφεται ο καθαρισμός και η ταυτοποίηση των πεπτιδίων με υγρή χρωματογραφία ανάστροφης φάσης και υψηλής διαχωριστικής ικανότητας και της φασματοσκοπίας μάζας ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό. Στη συνέχεια δίνονται οι αναλυτικές HPLC και τα φάσματα μάζας των καθαρών πεπτιδίων που παρασκευάσθηκαν. Στο Κεφάλαιο 11 περιγράφεται η CD ανάλυση και η διαμορφωτική μελέτη των πεπτιδίων που συντέθηκαν, σε διάφορους διαλύτες. Τέλος, γίνεται επεξεργασία των φασμάτων κυκλικού διχρωισμού των πεπτιδίων με το πρόγραμμα CDNN. Στο Κεφάλαιο 12 δίνεται η πορεία διεξαγωγής των πειραμάτων της διαμεμβρανικής μεταφοράς των πεπτιδίων με τη συνεστιακή μικροσκοπία και παράλληλα παρουσιάζονται οι φωτογραφίες των κυττάρων σε διάφορες τομές του. Στο Κεφάλαιο 13 περιγράφεται το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε για τη διεξαγωγή των βιολογικών πειραμάτων. Συγκεκριμένα περιγράφεται ο τρόπος με τον οποίο έγιναν οι καλλιέργειες δενδριτικών κυττάρων και παρατίθενται τα αποτελέσματα των πειραμάτων κυτταρομετρίας ροής και ELISA. Στο Κεφάλαιο 14 πραγματοποιείται μια σύντομη ανασκόπηση των βασικών αρχών και θεωριών στις οποίες βασίζεται η παρούσα εργασία με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία και παράλληλα σχολιάζεται το σύνολο των αποτελεσμάτων της παρούσας διατριβής. Στο Κεφάλαιο 15 αναφέρονται τα γενικά συμπεράσματα της παρούσας εργασίας, τα οποία είναι τα εξής: ♦ Παρασκευάσθηκαν CD8 επίτοποι του καρκινικού αντιγόνου MAGE 3 που ταυτοποιήθηκαν από ασθενείς στην ελεύθερη μορφή τους καθώς και προσδεδεμένοι στον φορέα SOCn, ώστε να βελτιωθεί η αντιγονική/ανοσολογική τους δράση. ♦ Μελετήθηκαν τα διαμορφωτικά τους χαρακτηριστικά με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού και επιβεβαιώθηκε ότι προσλαμβάνουν συγκεκριμένες διαμορφώσεις σε υδατικό και μικκυλιακό περιβάλλον. ♦ Έγινε ιχνηθέτηση των SOCn-παραγώγων με φλουορεσκεΐνη, και βρέθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία ότι διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη. ♦ Βιολογικά πειράματα σε μονοκύτταρα περιφερικού αίματος υγιών εθελοντών και σε δενδριτικά κύτταρα έδειξαν σημαντική ενεργοποίηση των CD8 κυττάρων, παραγωγή IFN-γ, ενώ δεν παρήχθη IL-4. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν τη δυνατότητα ανάπτυξης κυτταροτοξικής ανοσολογικής απόκρισης Thl. Στο Κεφάλαιο 16 παρουσιάζονται περιληπτικά το αντικείμενο και τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Στο Κεφάλαιο 17 παρουσιάζονται περιληπτικά το αντικείμενο και τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής στην Αγγλική γλώσσα. Στο Κεφάλαιο 18 δίνεται λεπτομερείς βιβλιογραφία σχετικά με τα θέματα που αναλύονται στην παρούσα διατριβή. Στο Κεφάλαιο 19 παρατίθενται τα 20 φυσικά αμινοξέα με τους συντακτικούς τους τύπους, οι συντομογραφίες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, καθώς και δημοσιεύσεις σε πρακτικά συνεδρίων και ομιλίες.