Μοριακές δομές των βακτηριακών φερρεδοξινών PaFd και EcFd

Abstract

Crystallization, data collection and structure analysis of the two [4Fe-4S] cluster ferredoxins (Fds) from the bacteria Pseudomonas aeruginosa (PaFd) and Escherichia coli (EcFd) are described in the present Ph.D. dissertation. Ferredoxins of the particular family that exhibit the special feature of different reduction potentials of the two iron-sulfur clusters, are referred in the literature as electron transfer proteins. Crystallization experiments of both PaFd and EcFd were carried out under inert conditions using correspondingly argon and nitrogen, as proteins of this family undergo oxidation reactions leading to their denaturation. For the preliminary crystallization tests commercially available crystallization kits were used, which were then modified combining the conditions that had been successful in other ferredoxins. The X-ray data were collected using synchrotron radiation at the European Molecular Biology Laboratory Hamburg using area detectors. PaFd was crystallized in the orthorhombic crystal system, in space group P212121, unit cell dimensions 39.1, 45.1, 51.9 A and the data were collected at the resolution 1.32 A. The structure was solved by the molecular replacement method, using the Allochromatium vinosum ferredoxin as a search model. The refinement proceeded up to R = 15% and the geometrical features of the final model were within the errors found in high resolution structures. The 1.32 A resolution, which is the highest up to now for a member of this family of Fds, allowed a detailed analysis of all intramolecular interactions, as well as of the geometry of the clusters. At the final stages of the refinement the cluster atoms were refined without any restraints, in order to determine their unbiased geometry. The PaFd structure revealed important structural information that allow the comparison of this class of ferredoxins with other high resolution ferredoxin structures, as to the impact of the structure on the reduction potentials. EcFd structure belonges in the hexagonal crystal system and was crystallized in space group P62. Its crystals were merohedral twins and thus showed higher symmetry than the real one. While the crystal belonged in the point group 6, its diffraction pattern appeared the symmetry of the higher symmetry point group 622. The initial difficulties in determining the structure overcame using detwinned data, while the real space group was proved to be P62 only after the completion of the refinement. The twin crystal was comprised of two parts in percentage 55% and 45% and the reflections h, k, l and k, h, -l were related as an effect of twinning. The refinement of the structure 116 proceeded with the least squares method, assuming for the calculated structure factors the linear combination: Fc 2 = α Fc1 2 + (1 – α) Fc2 2 where α the twin fraction and Fc1, Fc2 the calculated structure factors for the two parts of the crystal. As near perfect twinning effectively halves the number of observed reflection intensities at any given resolution, the 1.65 A resolution of the EcFd data essentially has the same information content as untwinned data at much lower resolution.

Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται η κρυστάλλωση, η συλλογή κρυσταλλογραφικών µένων και η ανάλυση της δοµής πρωτεϊνών της οικογένειας των φερρεδοξινών δύο πλειάδων 4S] από τα βακτήρια Pseudomonas aeruginosa (PaFd) και Escherichia coli (EcFd). Οι φερρεδοξίνες της συγκεκριµένης οικογένειας, οι οποίες εµφανίζουν το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της εγάλης διαφοράς των κανονικών δυναµικών αναγωγής µεταξύ των δύο πλειάδων σιδήρου – θείου, αναφέρονται στη βιβλιογραφία ως πρωτεΐνες µεταφοράς ηλεκτρονίων. Η κρυστάλλωση των PaFd και EcFd πραγµατοποιήθηκε υπό αδρανείς συνθήκες αργού και αζώτου αντίστοιχα, λόγω της ευαισθησίας τους κατά την έκθεση τους στο ατµοσφαιρικό οξυγόνο. Οι συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν αρχικά ήταν οι εµπορικά διαθέσιµες προπαρασκευασµένες συνθήκες, οι οποίες εν συνεχεία τροποποιήθηκαν συνδυάζοντας συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν επιτυχώς σε άλλες φερρεδοξίνες. Η συλλογή των κρυσταλλογραφικών δεδοµένων πραγµατοποιήθηκε ακτινοβολία συγχρότρου, στο Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας Αµβούργου, σε ανιχνευτές δύο διαστάσεων. Η PaFd κρυσταλλώθηκε σε ορθοροµβικό κρυσταλλικό σύστηµα, στην οµάδα χώρου P212121, διαστάσεις µοναδιαίας κυψελίδας 39.1, 45.1, 51.9 A και σε µέγιστη διακριτική ικανότητα 1.32 A. µή επιλύθηκε µε τη µέθοδο της µοριακής αντικατάστασης χρησιµοποιώντας ως µοντέλο τη δοµή φερρεδοξίνης Allochromatium vinosum. Η δοµή βελτιστοποιήθηκε µέχρι την τιµή R = 15% και το τελικό µοντέλο δεν παρουσίαζε καµία απόκλιση από τα γεωµετρικά χαρακτηριστικά των δοµών υψηλής διακριτικής ικανότητας. Η διακριτική ικανότητα των 1.32 A είναι η υψηλότερη που έχει επιτευχθεί σε φερρεδοξίνη της οικογένειας των 2[4Fe-4S] και επέτρεψε τη λεπτοµερή ανάλυση των µοριακών αλληλεπιδράσεων και της γεωµετρίας των πλειάδων σιδήρου – θείου, οι οποίες στα τελευταία στάδια βελτιστοποιήθηκαν χωρίς κανέναν περιορισµό. Από τη δοµή της PaFd αντλήθηκαν αντικές δοµικές πληροφορίες, που επέτρεψαν τη σύγκριση της δοµής της οικογένειας αυτής µε άλλες φερρεδοξίνες υψηλής διακριτικής ικανότητας, ως προς την επίδραση της δοµής στα κανονικά δυναµικά αναγωγής. Η EcFd έδωσε κρυστάλλους εξαγωνικής συµµετρίας, οµάδας χώρου P62, οι οποίοι ήταν µεροεδρικώς διπλοί και ως εκ τούτου εµφάνιζε υψηλότερη συµµετρία από την πραγµατική. Ενώ ο κρύσταλλος ανήκε στην οµάδα σηµείου 6, η περίθλαση του έδειχνε ότι ανήκε στην οµάδα σηµείου 622, δηλαδή υψηλότερης συµµετρίας οµάδα Laue. Παρά τις δυσκολίες στην επίλυση της δοµής, επιτεύχθηκε προσδιορισµός αρχικών φάσεων µε τη µέθοδο της µοριακής αντικατάστασης, 114 χρησιµοποιώντας κρυσταλλογραφικά δεδοµένα µερικώς διορθωµένα, ενώ πιστοποιήθηκε η πραγµατική οµάδα χώρου Ρ62 µόνο όταν η βελτιστοποίηση προχώρησε σε ικανοποιητικό σηµείο. Ο διπλός κρύσταλλος βρέθηκε ότι αποτελείτο από δύο επίµέρους κρυστάλλους σε ποσοστά ~ 55% και 45%, µε αποτέλεσµα οι ανακλάσεις h, k, l και k, h, -l να σχετίζονται. Η βελτιστοποίηση έγινε µε τη µέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων, και οι υπολογιζόµενοι παράγοντες δοµής προσδιορίστηκαν από τη σχέση: Fc 2 = α Fc1 2 + (1 – α) Fc2 2 όπου α το κλάσµα πολλαπλότητας και Fc1, Fc2 οι υπολογιζόµενοι παράγοντες δοµής των δύο επιµέρους κρυστάλλων. Τα κρυσταλλογραφικά δεδοµένα διακριτικής ικανότητας 1.65 A υποβαθµίζονται αρκετά, λόγω της ύπαρξης µεροεδρικώς διπλού κρυστάλλου, ώστε το τελικό µοντέλο να παρουσιάζει αρκετές αποκλίσεις από τα γεωµετρικά χαρακτηριστικά των δοµών υψηλής διακριτικής ικανότητας.