Συνθάση της εποξυλίνης με υπόστρωμα το αραχιδονικό οξύ. Βιολογική δράση της εποξυλίνης Α3 στα β-κύτταρα RINm5F.

Abstract

Current objective of the present study was HXA3, a hydroxy-epoxy compound, stem from 12S-HpETE, the primary deoxygenated product of AA by the 12-lipoxygenase. Since hepoxilins were discovered in 1983, a vast variety of biological actions came to light. Our investigations were concentrated on HXA3 effect on insulin secretion as well as cell growth and apoptosis of pancreatic ?-cells and the elucidation of the underlying signalling pathways. HXA3 induced insulin secretion in RINm5F cells in the absence or low levels of glucose but it exhibited the opposite effect at high glucose levels. This diversity of HXA3 action that was based on the amount of glucose present in the medium, was elucidated by investigating the corresponding signaling pathways that involve the ER resident kinases IRE1α and PERK. Our data revealed that HXA3 induces insulin secretion and biosynthesis via the same signaling cascade as glucose in oxidatively stressed pancreatic β-cells suggesting that under oxidative stress conditions HXA3 is formed and induces insulin secretion so as to reconstitute the system equilibrium which is disturbed. Moreover, we provided the first evidence for the implication of Ga and Gi proteins in the GPCR-coupled action of HXA3 on insulin secretion by showing that HXA3 induced insulin secretion by triggering Ga13 signaling via G2A receptor resulting in activation of IRE1α and PERK which tightly regulate pro-insulin production and sustain ?-cell integrity. Furthermore, we investigated the role of HXA3 on the viability and growth of ?-cells. In comparison which 12HpETE which induced apoptosis via the extrinsic pathway HXA3 not only prevented it but promoted cell proliferation. In particular, HXA3 was found to suppress the pro-apoptotic BAX and upregulate the antiapoptotic Bcl-2. HXA3 also induced the anti-apoptotic 12S-LOX via HSP90 recruitement which is known to possess an anti-apoptotic and cell proliferative role. Moreover, HXA3 counteracted oxidative stress-induced apoptosis by dephopshorylating and thus inactivating apoptosis signal-regulating kinase 1 via PP5 upregulation. This cell protective role was further supported by the fact that submicromolar HXA3 were able to transiently activate ERK-1 and ERK-2, an effect exerted also by growth factors and cytokines leading to cell survival. Lastly, HXA3 enhanced a 3-fold the basal level of PHGPx mRNA in RINm5F cells whereas 12S-HpETE and 12-HETE had no effect. To our knowledge this is the first evidence for the upregulation of the expression of PHGPx by eicosanoids. Among the various biological actions, HXA3 has been shown be a key regulator of inflammation. In the present study we examined HXA3 role on inflammation of pancreatic ?-cells. 115ΠΕΡΙΛΗΨΗ HXA3 upregulated the pro-inflammatory iNOS in a protein as well as in an mRNA level. Moreover, HXA3 selectively induced COX-2 protein and not COX-1 only under the presence of oxidative stress and contributed to PGE2 production. In particular, sub-micromolar concentrations of HXA3 activated NF-kB which translocated to the nucleus and bound to COX-2 promoter to turn on the gene transcription which led to the upregulation of the COX-2 mRNA and protein levels. Interestingly, this action was reduced by a preicubation step with pertussis toxin suggesting the implication of a Gi-coupled receptor. Finally, we reported a novel form of autosomal recessive congenital ichthyosis, HXALI. In this case report 8R/S-HXA3, which is inevitably required to avoid the water barrier dysfunction, was not formed since the responsible biosynthetic enzymes, HXA3 synthase and eLOX3, were absent from the patient/s skin. 116

Αντικείμενο της παρούσας ερευνητικής εργασίας αποτέλεσε η μελέτη της HXA3, ενός εποξυ-υδροξυ παραγώγου της 12S-HpETE, που αποτελεί το πρωταρχικό προϊόν διοξυγόνωσης του ΑΑ από την 12-LOX. Από την ανακάλυψη των εποξυλινών το 1983, μια πληθώρα βιολογικών δράσεων έχουν έρθει στο φως. Οι έρευνες μας επικεντρώθηκαν στην επίδραση της HXA3 στην έκκριση ινσουλίνης και στην απόπτωση των β-παγκρεατικών κυττάρων RINm5F καθώς και στην διαλεύκανση των υπεύθυνων σηματοδοτικών πορειών. Η HXA3 οδήγησε στην επαγωγή της έκκρισης ινσουλίνης στα κύτταρα RINm5F απουσία ή παρουσία χαμηλών επιπέδων γλυκόζης ενώ είχε το αντίθετο αποτέλεσμα όταν η συγκέντρωση γλυκόζης έφτασε τα 25mM. Η δράση της HXA3 στην έκκριση ινσουλίνης η οποία ήταν αντιστρόφως ανάλογη των επιπέδων γλυκόζης στο μέσο ανάπτυξης των κυττάρων διευκρινίστηκε με την μελέτη της σηματοδοτικής πορείας που, όπως διαπιστώθηκε, περιλαμβάνει τις κινάσες IRE1α και PERK. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι η HXA3 επάγει την έκκριση ινσουλίνης καθώς και την βιοσύνθεση της στα στρεσαρισμένα κύτταρα RINm5F μέσω της ίδιας πορείας με την γλυκόζη. Με άλλα λόγια κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες σχηματίζεται η HXA3 και επάγει την έκκριση ινσουλίνης ώστε να αποκαταστήσει την διαταρραγμένη ισορροπία του συστήματος. Στην συνέχεια, βρήκαμε ότι η δράση της HXA3 στην έκκριση ινσουλίνης πραγματοποιείται μέσω του υποδοχέα G2A και της πρωτεΐνης Gα13 που πυροδοτούν μια σηματοδοτική πορεία που έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των IRE1α και PERK, ρυθμιστών της βιοσύνθεσης προ-ινσουλίνης και της ακεραιότητας των β-κυττάρων, αντίστοιχα. Στην συνέχεια, μελετήσαμε τον ρόλο της HXA3 στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών κυττάρων RINm5F. Σε αντίθεση με το 12HpETE που οδήγησε στην απόπτωση μέσω της εξωγενούς πορείας η HXA3 όχι μόνο οδήγησε στην επιβίωση αλλά και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Συγκεκριμένα, η HXA3 ανέστειλε τον προ-αποπτωτικό παράγοντα BAX ενώ ευόδωσε την έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2. Ακόμη, βρέθηκε οτι η HXA3 επάγει την αντι αποπτωτική 12S-LOX επιστρατεύοντας την HSP90 η οποία είναι γνωστό ότι διαθέτει όχι μόνο αντι αποπτωτικές αλλά και πολλαπλασιαστικές ιδιότητες. Έπειτα, η HXA3 αντιμετώπισε την απόπτωση που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες αποφωσφορυλυνιώνοντας και συνεπώς απενεργοποιώντας την κινάση ASK1 μέσω ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής φωσφατάσης PP5. Ο προστατευτικός ρόλος της HXA3 υποστηρίχτηκε ακόμη περισσότερο από το γεγονός ότι ενεργοποιεί τις MAPK, ERK-1 και 113ΠΕΡΙΛΗΨΗ ERK-2, οι οποίες φωσφορυλιώνονται κυρίως από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες οδηγώντας στην επιβίωση και ανάπτυξη των κυττάρων. Τέλος, η HXA3 ενίσχυσε σημαντικά τα χαμηλά επίπεδα PHGPx στα κύτταρα RINm5F με αποτέλεσμα την μείωση του οξειδωτικού στρες το οποίο είναι υπεύθυνο για την ευαισθησία των κυττάρων αυτών στην απόπτωση. Εδώ θα πρέπει να τονίσουμε ότι είναι η πρώτη φορά όπου ένα εικοσανοειδές βρέθηκε να ευοδώνει την έκφραση της PHGPx. Μεταξύ των άλων βιολογικών της δράσεων η HXA3 έχει δειχτεί ότι αποτελεί πολύ σημαντικό ρυθμιστικό παράγοντα της ανάπτυξης φλεγμονής. Στην παρούσα εργασία, εξετάσαμε τον ρόλο HXA3 στην φλεγμονή των β-κυττάρων. Η HXA3 οδήγησε στην υπερέκφραση του προ-φλεγμονώδους ενζύμου iNOS τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA. Στην συνέχεια διαπιστώθηκε ότι η ΗXA3 επάγει ειδικά την COX-2 και όχι την COX-1 μόνο υπό την παρουσία οξειδωτικού στρες και συμβάλλει σημαντικά στην παραγωγή της PGE2. Συγκεκριμένα, υπομικρομοριακές συγκεντρώσεις HXA3 ενεργοποίησαν τον NF-kB που μετατοπίστηκε στον πυρήνα και προσδέθηκε στον υποκινητή της COX-2 ενερογοποιώντας την μεταγραφή του γονιδίου που οδήγησε τελικά στην αύξηση τόσο των επιπέδων mRNA όσο και της πρωτεΐνης. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι προεπώαση των κυττάρων με την τοξίνη του κοκκύτη μείωσε εμφανώς την δράση αυτή υποδεικνύοντας την εμπλοκή ενός Gi-συζευγμένου υποδοχέα στην δράση αυτή. Τέλος, διαπιστώσαμε την ύπαρξη μιας νέας μορφής αυτοσωμικής υπολειπόμενης συγγενούς ιχθύωσης (ARCIs), που συνδέεται με την συνθάση της ΗΧA3, και η οποία ονομάστηκε HXALI (Hepoxilin A3 Synthase-linked Ichthyosis). Σε αυτή την ειδική περίπτωση, δεν σχηματίζεται η 8R/S-HXA3, που είναι απαραίτητη για την προστασία του δέρματος από δυσλειτουργία του υδατικού φραγμού, εξαιτίας της απουσίας των υπευθύνων βιοσυνθετικών ενζύμων δηλαδή της συνθάση της HXA3 και της eLOX3 από το δέρμα του ασθενή