Βιοχημική και μοριακή ανάλυση της β-τύπου αφυδατάσης των δικαρβονικών στο φυτό Arabidopsis thaliana

Abstract

Carbonic anhydrase (EC: 4.2.1.1) is a widespread enzyme that catalyzes the interconversion of CO₂ and HCΟ₃⁻. It is found in at least five distinct CA families, designated as a, β, γ, δ και ζ, in diverse species from all three evolutionary branches. With no primary sequence homology, enzymes of each family appear to have evolved independently. However, it seems that they share a common catalytic mechanism with a metal ion, usually zing, in its active site. Although each family have been associated with a specific group of organisms (a, vertebrates; β, plants and prokaryotes; y, Archaea; δ, marine diatoms), genomic analysis revealed the presence of from more than one CA classes within a single organism. In silico analysis in the C3 plant Arabidopsis thaliana identified at least nineteen genes likely to encode CA isoforms representing the α, β and γ families. Six of these belong to the β-type and are represented in the EST database, proving that they are all transcripted into mRNA. Polypeptides coded by those six genes show high similarity among them. Three are predicted to have cytoplasmic localization, two chloroplastic and one mitochondrial topology. RT-PCR analysis with specific primers revealed the presence of the six βAtca transcripts in all the Arabidopsis organs that have been studied, also suggesting their ability to trinscripted into mRNA. However, the difference in their expression patterns implies that they may play diverse roles in biological and physiological processes of Arabidopsis. Carbonic anhydrase is involved in a wide range of eukaryotic physiological processes, including respiration, photorespiration, glyconeogenesis, lipogenesis and photosynthesis, with distinct, however, biochemical roles among C3 and C4 plants. In C3 plants, where it’s localized mainly in the leaf chloroplasts, it has been postulated that CA activity could maintain the supply of CO₂ for Rubisco, the central enzyme in C3 photosynthesis. In C4 plants, CA is found primarily within the cytosol of mesophyll cells where it catalyzes the hydration of CO₂ to bicarbonate, the substrate of PEPC. Resent reports indicate CA activity in the lumen of plant thylakoids, suggesting a relation with the photosystem II. Except of its role in photosynthesis, CA is also involved in many other independent processes, including fatty acid metabolism and mobilization of carbon storages. These processes seem to be crucial for seedling establishment and transition of plants from lipid base heterotrophic growth to photoautotrophic metabolism. Other physiological roles of CA are related to processes which take place in the cytoplasm or mitochondria. In the first case, CAs are involved mainly in the maintenance of Ci equilibrium while in the second in the efficient recycling of mitochondrial Ci for CO₂ fixation in chloroplasts. Taken into account the literature references related to βCAs, we tried to further investigate their physiological role in the model plant Arabidopsis thaliana. For this purpose RNA-RNA in situ hybridization was applied in order to analyze the expression pattern of the six βAtca genes in section of three different plant organs, including stems, siliques and flowers. The results revealed a differing but overlapping expression pattern of these genes suggesting possible synergetic roles among βCAs in Arabidopsis. The in vitro activity of the mitochondrial βAtCA4 was analyzed through heterologous expression in Escherichia coli. βAtCA4 is the only member of the βCA family in Arabidopsis which does not seem to complement the growth defects of a βCA deletion strain from the yeast Saccharomyces cerevisiae. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and the enzyme activity was determined through spectrophotometric assay. The activity assay against the substrate NaHCΟ₃ revealed the ability of the recombinant βAtCA4 to bind HCΟ₃⁻. The reaction, tested in a range of substrate concentrations, display Michaelis-Menten kinetics. Determination of the rate constant, Km, and the specificity constant, kcat/Km, showed that the recombinant βAtCA4 has low affinity and catalytic efficiency for HCΟ₃. Possible physiological roles of the βCAs coded by the Atca1, Atca3, Atca4 και Atca5 genes were investigated using homozygous T-DNA lines for each gene. Their phenotype was checked in order to discover if the loss-of-function mutations induces morphological polymorphisms in Arabidopsis plants. Apart from the homozygous lines, a possible null Atca3 mutant was analyzed displaying a lethal phenotype with altered pigmentation and morphological defects. Genetic analysis revealed that all of the observed phenotypic classes pass from one generation to another, however, with altered frequencies in each generation. Heterozygous seeds mutated at AtCA3 when grown on plates supplemented with sucrose and at low light intensity condition couldn’t restore seedling establishment. That suggests a metabolic rather than photosynthetic role for AtCA3 isoform in seedling establishment. Furthermore, mutants and wild type plants were treated with various stress factors, including osmotic factor, salinity, ABA, IAA and CHY, which are known to affect the transcript levels of the four βAtca genes. Stressed and non-stressed plants were analyzed phenotypically and checked by Real-Time PCR for possible changes in their expression levels. The results indicate their involvement in many plant processes and presumably in Arabidopsis response to several environmental stress conditions. The roles attributed to the four βAtCA isoenzymes seem to be dependent on their subcellular localization and the specific biochemical processes that take place in each cell compartment.

Η καρβονική ανυδράση (EC: 4.2.1.1) αποτελεί ένα από τα πλέον διαδεδομένα ένζυμα, που καταλύει την αλληλομετατροπή CΟ₂ και HCΟ₃⁻. Απαντά σε οργανισμούς και των τριών κλάδων της εξέλιξης, στους οποίους εμφανίζεται με τη μορφή πέντε τουλάχιστον τύπων, των α-, β-, γ-, δ και ζ. Τα ένζυμα των πέντε αυτών κατηγοριών δεν παρουσιάζουν ομολογία μεταξύ τους, γεγονός που υποστηρίζει την ανεξάρτητη εξελικτική τους πορεία. Ωστόσο, χαρακτηρίζονται από έναν κοινό μηχανισμό κατάλυσης, με το ενεργό του κέντρο να διαμορφώνεται από ένα σύμπλοκο μετάλλου, κυρίως ψευδαργύρου. Τα ένζυμα της κάθε κατηγορίας συνδέονται, σε γενικές γραμμές, με συγκεκριμένη ομάδα οργανισμών. Παρόλα αυτά υπάρχουν και περιπτώσεις, όπως τα φυτά, που διαθέτουν περισσότερους του ενός τύπους των καρβονικών ανυδρασών. Στο Arabidopsis thaliana, ένα C3 φυτικό μοντέλο, η in silico ανάλυση είχε ως αποτέλεσμα την αναγνώριση δεκαεννέα γενετικών τόπων, οι οποίοι κωδικοποιούν, πιθανώς, για καρβονικές ανυδράσες των τριών πρώτων τύπων. Ειδικότερα, έξι από αυτούς αντιπροσωπεύουν β-τύπου ισοένζυμα, χαρακτηριστικά, άλλωστε, των φυτικών οργανισμών. Το γεγονός ότι και οι έξι αυτοί γενετικοί τόποι αντιπροσωπεύονται στις βάσεις δεδομένων από EST, υποδεικνύει τη δυνατότητα έκφρασής τους σε μεταγραφικό επίπεδο. Τα κωδικοποιούμενα πολυπεπτίδια παρουσιάζουν υψηλή ομολογία μεταξύ τους, η οποία ελαττώνεται μόνο στο 5’ και 3’ άκρο τους. Μεταξύ αυτών, τρία φαίνεται πως δραστηριοποιούνται στο κυτταρόπλασμα, δύο κατευθύνονται στους χλωροπλάστες και ένα έχει μιτοχονδριακή τοπολογία. Η RT-PCR ανάλυση με τη χρήση εξειδικευμένων εκκινητών αποκάλυψε την παρουσία μεταγραφημάτων των έξι γενετικών τόπων σε όλα τα επιμέρους όργανα του Arabidopsis, γεγονός που, μεταξύ άλλων, συνηγορεί υπέρ της δυνατότητάς τους να μεταγράφονται σε mRNA. Ωστόσο, τα διαφοροποιημένα πρότυπα έκφρασης, που παρουσιάζουν, αποτελούν ενδεχομένως ένδειξη των διακριτών ρόλων που επιτελούν στον φυτικό αυτό οργανισμό. Η καρβονική ανυδράση εμπλέκεται σε πλήθος φυσιολογικών διαδικασιών των ευκαρυωτών, όπως η αναπνοή, η φωτοαναπνοή, η νεογλυκογένεση, η λιπογένεση και η φωτοσύνθεση, με διαφορετικούς, σε κάποιες περιπτώσεις, βιοχημικούς ρόλους στα C3 και C4 φυτά. Στα πρώτα, δραστηριοποιείται, κυρίως, στους χλωροπλάστες των φύλλων όπου συμβάλλει στη διατήρηση της παροχής CΟ₂ στο βασικό ένζυμο της φωτοσύνθεσης των C3 φυτών, τη Rubisco. Στα C4 φυτά, το μεγαλύτερο μέρος της βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα κυττάρων του μεσοφύλλου. Στην περίπτωση αυτή συμβάλλει στον εφοδιασμό της PEPC με το κατάλληλο για τη δράση της υπόστρωμα, δηλαδή τα HCΟ₃⁻, καθιστώντας αποτελεσματικότερη τη δέσμευση του CΟ₂ από την ατμόσφαιρα και τον εγκλωβισμό του στο εσωτερικό των φύλλων. Επιπλέον, πρόσφατα αναφέρθηκε η δράση της καρβονικής ανυδράσης στο lumen των θυλακοειδών ανώτερων φυτών η οποία φαίνεται ότι συνδέεται με τη λειτουργία του φωτοσυστήματος II. Ωστόσο, εκτός από την εμπλοκή του στη φωτοσύνθεση, το ένζυμο αυτό φαίνεται ότι επιτελεί και ρόλους ανεξάρτητους της παραπάνω διαδικασίας. Ένας από αυτούς σχετίζεται με τον μεταβολισμό των λιπαρών οξέων τόσο κατά τη διαδικασία της λιπογένεσης στα αναπτυσσόμενα έμβρυα όσο και κατά τη διακίνηση των ανθρακικών τους αποθεμάτων. Ο ρόλος αυτός εξυπηρετεί την εδραίωση των νεαρών εκφύτων κατά το λεγόμενο «μεταβατικό στάδιο» από την ετερότροφη ανάπτυξη στον φωτοαυτότροφο μεταβολισμό. Άλλοι πιθανοί ρόλοι σχετίζονται με διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα σε μέρη του κυττάρου πέρα από τους χλωροπλάστες, όπως το κυτταρόπλασμα και τα μιτοχόνδρια. Στην πρώτη περίπτωση οι καρβονικές ανυδράσες εμπλέκονται, κυρίως, στη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ των δύο ανόργανων μορφών άνθρακα ενώ στη δεύτερη με την ανακύκλωσή τους για τον εφοδιασμό και την αποτελεσματικότερη αφομοίωση του CΟ₂ στους χλωροπλάστες. Αξιοποιώντας το πλήθος των βιβλιογραφικών αναφορών που σχετίζονται με τις β- καρβονικές ανυδράσες, διερευνήσαμε περαιτέρω τον ρόλο τους στο φυτό Arabidopsis thaliana. Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκε αρχικά η χωροταξική κατανομή μεταγραφήμάτων των έξι βAtca γονιδίων μέσω του in situ RNA-RNA υβριδισμού σε εγκάρσιες τομές βλαστών, χεδρώπων και ανθέων. Η επιλογή φυτικών οργάνων με διαφορετική φωτοσυνθετική ικανότητα στόχευε στη διερεύνηση της εμπλοκής των εν λόγω ενζύμων τόσο σε φωτοσυνθετικές όσο και, πιθανά, σε μεταβολικές διαδικασίες των φυτών. Η παραπάνω μελέτη αποκάλυψε, σε γενικές γραμμές, αλληλοεπικαλυπτόμενα χωροταξικά πρότυπα έκφρασης των έξι γονιδίων, γεγονός που μπορεί να αποδοθεί σε πιθανή συνεργιστική δράση των β-καρβονικών ανυδρασών στο Arabidopsis.. Επιπλέον, μελετήθηκε η in vitro λειτουργικότητα της μιτοχονδριακής βAtCA4 μέσω ετερόλογης έκφρασής της σε βακτηριακό σύστημα Escherichia coli. Η βAtCA4 είναι η μόνη από τα έξι β-τύπου ισοένζυμα στο Arabidopsis η οποία δεν φαίνεται να συμπληρώνει λειτουργικά μεταλλαγμένο στέλεχος της ζύμης Saccharomyces cerevisiae, ως προς τις β-καρβονικές ανυδράσες, υπό αερόβιες συνθήκες. Μετά την έκφρασή της στο παραπάνω ετερόλογο βακτηριακό σύστημα η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη απομονώθηκε με χρωματογραφία χημικής συγγένειας και ελέγχθηκε λειτουργικά με μετρήσεις ενζυμικής δραστικότητας μέσω φωτομετρικού προσδιορισμού. Οι δοκιμές δραστικότητας πραγματοποιήθηκαν έναντι υποστρώματος NaHCΟ₃ απ’ όπου διαπιστώθηκε η ικανότητα της ανασυνδυασμένης βAtCA4 να δεσμεύει δικαρβονικά ιόντα. Η ανάλυση της κινητικής του ενζύμου έναντι διάφορων συγκεντρώσεων του παραπάνω υποστρώματος αποκάλυψε ότι αυτή ακολουθεί το μοντέλο των Michaelis-Menten. Από τον προσδιορισμό της κινητικής σταθεράς Km και του λόγου kcat/Km προέκυψε ότι η ExAtCA4 επιδεικνύει μικρή συγγένεια και αποδοτικότητα έναντι των HCO₃⁻. Για τη διερεύνηση πιθανών φυσιολογικών ρόλων των β-καρβονικών ανυδρασών που κωδικοποιούνται από τα γονίδια Atca1, Atca3, Atca4 και Atca5 χρησιμοποιήθηκαν ομόζυγες Τ-DNA μεταλλαγμένες σειρές. Αυτές εξετάστηκαν φαινοτυπικά και διαπιστώθηκε ο βαθμός κατά τον οποίο η μερική ή πλήρης απώλεια της δραστηριότητας καθενός από τα παραπάνω ένζυμα επηρεάζει τη μορφολογία των φυτών Arabidopsis. Εκτός από τις ομόζυγες μεταλλάξεις, μελετήθηκε και μια πιθανότατα μηδενική (null) μετάλλαξη του Atca3 γονιδίου, η οποία φαίνεται ότι παρουσιάζει θνησιγενή φαινότυπο με μορφολογικές και χρωματικές αλλοιώσεις σε έμβρυα και νεαρά φυτάρια. Οι αλλοιώσεις αυτές φαίνεται να διατηρούνται στα τέσσερα διαδοχικά γενετικά υπόβαθρα που μελετήθηκαν. Ωστόσο, τα ποσοστά τους εμφανίζονται διαφοροποιημένα μεταξύ των διαφόρων γενεών, γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι οι παρατηρούμενοι θνησιγενείς φαινότυποι αποτυπώνονται μόνο μερικώς στο γονιδίωμα των απογόνων της μετάλλαξης αυτής. Η ανάπτυξη ετερόζυγων μεταλλαγμένων φυτών σε θρεπτικά υποστρώματα διαφορετικής συγκέντρωσης σακχαρόζης και υπό συνθήκες χαμηλής έντασης φωτός δεν κατέστη δυνατό να αποκαταστήσει την επιβίωση των ομόζυγων φυτών. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει έναν πιθανώς μεταβολικό παρά φωτοσυνθετικό ρόλο του Atca3 γονιδίου κατά τα στάδια της εδραίωσης των νεαρών φυτών. Για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου των τεσσάρων παραπάνω καρβονικών ανυδρασών επιχειρήθηκε επαγωγή όσο το δυνατό εντονότερων φαινοτυπικών διαφοροποιήσεων μεταξύ αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων φυτών. Αυτό κατέστη δυνατό με την εφαρμογή περιβαλλοντικών συνθηκών καταπόνησης όπως η ώσμωση, η αλατότητα, οι φυτικές ορμόνες (ΑΒΑ και ΙΑΑ) και τα αντιβιοτικά (CHY). Ακολούθως, καταπονημένα και μη φυτά εξετάστηκαν ως προς τον φαινότυπο και τη μεταγραφική συμπεριφορά των τεσσάρων βAtca γονιδίων. Από τη σύνθεση των αποτελεσμάτων, που προέκυψαν, φαίνεται ότι τα εν λόγω ένζυμα εμπλέκονται σε ένα μεγάλο εύρος φυσιολογικών λειτουργιών του Arabidopsis και, ενδεχομένως, σε μηχανισμούς απόκρισης των φυτών σε δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες. Οι ρόλοι που αποδίδονται στα τέσσερα αυτά ισοένζυμα φαίνεται ότι σχετίζονται με τις εξειδικευμένες λειτουργίες που επιτελούν τα διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα στα οποία δραστηριοποιείται καθένα από αυτά.