Παράγοντες που επηρεάζουν τον in vitro και με φυλλοφόρα μοσχεύματα πολλαπλασιασμό της ξυλοκερατιάς

Abstract

The carob tree (Ceratonia siliqua L.) is an evergreen tree of slow growth cultivated from antiquity in the Mediterranean region. Since carob tree has many uses (animal food, food industry, medicines, cosmetics and chemicals, apiarian and ornamental plants, production of bioethanol) and has minimal soil and cultural requirements it could be cultivated in various regions with mild climatic conditions, mainly in southern Greece. The aim of the present thesis was to investigate the main factors (e.g. juvenility, gene expression, biochemical factors, plant growth regulators), which influence propagation of carob tree with leafy stem cuttings and by in vitro methods. Differentially expressed genes in adult and juvenile shoot tissue of carob tree were determined with the technique of suppression subtractive hybridization (SSH). The results obtained indicate the existence of many differentially expressed genes in carob tree shoots and the expression of these genes depends on the developmental stage of the shoot and the shoot collection season. These genes encode enzymes, such as starch synthase I, P-type ATPase, diguanylate phosphodiesterase, kinases and proteins, such as MdMads2.1, GTP-binding, FRUITFUL-like, proteins involved in chloroplast topology, unknown, etc. The differentially expressed isolated genes are possibly involved in several physiological and morphological aspect of juvenility in carob tree. For example, genes that encode the enzyme starch synthase I and various proteins is possible to promote rooting in the juvenile cuttings. In the propagation of carob tree with leafy stem cuttings various factors, such as the physiological age of the shoot, the season of shoot collection, the type and the concentration of exogenically applied auxins were investigated. In adult and juvenile carob tree shoots biochemical factors that are related with the rhizogenesis, such as the soluble sugars (total and the main ones analytically), starch, total phenol compounds, total o-diphenols, total nitrogen (N) and the ratio total nonstructural carbohydrates/nitrogen (C/N) were investigated in all seasons. Correlation between these factors with the rooting percentage, the number and the mean length of roots of cuttings was investigated. The juvenile shoots had significantly higher rooting percentage and a greater number and mean length of roots per cutting, compared to the adult shoots in the two experimental years. Cuttings that were collected in spring gave a higher rooting percentage as well as more and longer roots, in comparison to those from the other seasons. Application of indole-3-butyric acid (IBA) in the base of the cuttings gave a considerably higher rooting percentage and a greater number and mean length of roots, compared to the β-naphthalenacetic acid (β-ΝΑΑ) and control, in all seasons, in both shoot ages in both the experimental years. The adult shoots had a statistically significant higher concentration of total N, compared to the juvenile shoots, in all seasons in the two experimental years. The adult shoots - with minor exceptions - had a higher concentration of total phenol compounds, total o-diphenols, sucrose, pinitol, fructose, total sugars, total nonstructural carbohydrates and the C/N ratio, in comparison with the juvenile shoots, in all seasons, in the two years. The results showed that there was statistically considerable negative correlation between the rooting percentage, the number and the mean length roots of carob shoots (adult and juvenile) that were not treated with auxins (control) and their concentration of total N, total phenol compounds (only in year 2004 for the mean length), total o-diphenols (only in year 2004 for the mean length) and pinitol for both years. Moreover, it was found that there was statistically considerable positive correlation between the rooting percentage, the number and the mean of length of produced roots of cuttings and their concentration of starch and with the C/N ratio (only in year 2005 for the mean length) in the two experimental years. During the in vitro propagation of carob tree, explants taken from young seedlings were established successfully with the application of 10% sodium hypochlorite (NaOCl) for 12 minutes. At the multiplication stage, explants showed better response (greater number and mean root length per explant and number of nodes per shoot) and ‘behavior’ in their growth (no tip and leaf necrosis) in Murashige and Skoog (MS) medium. An increase of cytokinine concentration in the medium increased the number of shoots per explant and callus and reduced the mean length of shoots per explant and nodes per shoot. The application of benzyladenine (BA) induced, independent of the concentration, a greater number of shoots per explant compared to application of 2-isopentyladenine (2iP). However, at the same concentration, application of 2iP resulted in a greater number of nodes per shoot in comparison with BA. At the root formation stage, the utilization of the two stage method gave higher rooting percentages in carob explants. The combination of 1 mg L⁻¹ IBA in the medium and incubation of the explants for 10 days had the best results, giving high rooting percentage (95%), adequate number of roots (almost 6 roots per explant), relatively high mean root length (1.8 cm) and small callus, after total incubation of explants for three weeks in the growth chamber. The rooted explants acclimatized very well, having high percentages of survival of approximately 90%. In conclusion, the carob tree is propagated successfully with leafy stem cuttings and by in vitro methods. The use of juvenile plant material had a positive effect on carob propagation with leafy stem cuttings, as gave high rooting percentage and great number and mean length of roots, and by in vitro methods, as it allowed the establishment of the explants without problems. The use of plant growth regulators had a positive effect on carob propagation, for both methods, while the differentially expressed isolated genes and the determination of various biochemical factors in carob shoots helped to explain the propagation of carob tree, with leafy stem cuttings.

Η ξυλοκερατιά (κν. χαρουπιά) (Ceratonia siliqua L.) είναι δένδρο αειθαλές, βραδείας ανάπτυξης, το οποίο ευδοκιμεί από την αρχαιότητα στην περιοχή της Μεσογείου. Η ξυλοκερατιά, λόγω των πολλών χρήσεών της (ζωοτροφή, βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων, καλλυντικών και χημικών, μελισσοκομικό και καλλωπιστικό φυτό, παραγωγή βιοαιθανόλης,) αλλά και των μικρών απαιτήσεών της σε έδαφος και καλλιεργητικές φροντίδες, θα μπορούσε να επεκταθεί σε διάφορες περιοχές με ήπιες κλιματικές συνθήκες, κυρίως της νότιας Ελλάδας. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη των σπουδαιότερων παραγόντων (νεανικότητα, έκφραση γονιδίων, βιοχημικοί παράγοντες, φυτορυθμιστικές ουσίες, κ.ά.), που επηρεάζουν τον in vitro όσο και με φυλλοφόρα μοσχεύματα πολλαπλασιασμό της ξυλοκερατιάς. Η απομόνωση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε ενήλικο και νεανικό βλαστό ξυλοκερατιάς πραγματοποιήθηκε με την τεχνική του κατασταλτικού αφαιρετικού υβριδισμού (suppression subtractive hybridization, SSH). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν την ύπαρξη αρκετών διαφορετικά εκφραζόμενων γονιδίων στους βλαστούς της ξυλοκερατιάς, η έκφραση των οποίων εξαρτάται από τη φυσιολογική ηλικία και την εποχή συλλογής του βλαστού. Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν ένζυμα (π.χ. συνθάση I του αμύλου, τύπος Ρ ΑΤΡάσης, διγουανυγική φωσφοδιεστεράση, κινάση), πρωτεΐνες (π.χ. MdMads2.1, GTP-binding, FRUITFUL-like, χλωροπλαστικής τοπολογίας, άγνωστες), κ.ά. Τα γονίδια που εντοπίστηκαν, είτε όταν εκφράζονται είτε όταν καταστέλλεται η έκφρασή τους, ενδεχομένως να σχετίζονται με ορισμένες από τις μορφολογικές και φυσιολογικές εκδηλώσεις της νεανικότητας στην ξυλοκερατιά. Για παράδειγμα, τα γονίδια που κωδικοποιούν το ένζυμο συνθάση I του αμύλου καθώς και διάφορες πρωτεΐνες πιθανόν να συμβάλλουν, δια της παραγωγής αμύλου και πρωτεϊνών, στην ευκολία ριζογένεσης των νεανικών της μοσχευμάτων. Κατά τον πολλαπλασιασμό της ξυλοκερατιάς με φυλλοφόρα μοσχεύματα διερευνήθηκαν διάφοροι παράγοντες, όπως η φυσιολογική ηλικία του μοσχεύματος, η εποχή συλλογής του καθώς ο τύπος και η συγκέντρωση της εξωγενώς εφαρμοζόμενης αυξίνης. Σε ενήλικους και νεανικούς βλαστούς ξυλοκερατιάς προσδιορίστηκαν, σε όλες τις εποχές του έτους, βιοχημικοί παράγοντες που σχετίζονται με τη ριζογένεση, όπως τα διαλυτά σάκχαρα (ολικά και τα κυριότερα, αναλυτικά), το άμυλο, οι ολικές φαινολικές ουσίες, οι ολικές ο-διφαινόλες, το ολικό άζωτο (Ν) καθώς και η σχέση των ολικών μη δομικών υδατανθράκων προς το άζωτο (C/N). Επίσης, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση μεταξύ των ανωτέρω βιοχημικών παραγόντων και του ποσοστού ριζοβολίας, καθώς και του αριθμού και του μέσου μήκους των ριζών των μοσχευμάτων. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι σε όλες τις εποχές τα νεανικά μοσχεύματα παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας και μεγαλύτερο αριθμό και μέσο μήκος ριζών ανά μόσχευμα, σε σύγκριση με τα ενήλικα και στις δύο πειραματικές χρονιές. Τα μοσχεύματα που συλλέχθηκαν την άνοιξη παρουσίασαν υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας και μεγαλύτερο αριθμό και μέσο μήκος ριζών, σε σύγκριση με τις υπόλοιπες εποχές. Η εμβάπτιση της βάσης των μοσχευμάτων σε ινδολυλοβουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) έδωσε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας και μεγαλύτερο αριθμό και μέσο μήκος ριζών, σε σύγκριση με το β-ναφθαλινοξικό οξύ (β-ΝΑΑ) και το μάρτυρα, σε όλες τις εποχές και στις δύο ηλικίες μοσχευμάτων και επίσης και στις δύο χρονιές. Οι ενήλικοι βλαστοί είχαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση ολικού αζώτου, σε σύγκριση με τους νεανικούς, σε όλες τις εποχές και στις δύο χρονιές. Επίσης, οι ενήλικοι βλαστοί - πλην ελάχιστων εξαιρέσεων - είχαν υψηλότερη συγκέντρωση ολικών φαινολικών ουσιών, ολικών ο-διφαινολών, σακχαρόζης, πινιτόλης, φρουκτόζης, ολικών σακχάρων, ολικών μη δομικών υδατανθράκων, καθώς και μεγαλύτερη σχέση ολικών μη δομικών υδατανθράκων προς άζωτο, σε σύγκριση με τους νεανικούς, σε όλες τις εποχές και στις δύο χρονιές. Από τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε η ύπαρξη στατιστικά σημαντικής αρνητικής συσχέτισης μεταξύ του ποσοστού ριζοβολίας και του αριθμού και του μέσου μήκους των παραγομένων ριζών των μοσχευμάτων (ενήλικων και νεανικών) της ξυλοκερατιάς που δεν μεταχειρίστηκαν με αυξίνη (μάρτυρας) με τη συγκέντρωσή τους σε ολικό άζωτο, ολικές φαινολικές ουσίες (μόνο το έτος 2004 για το μέσο μήκος), ολικές ο-διφαινόλες (μόνο το έτος 2004 για το μέσο μήκος) και πινιτόλης και στις δύο πειραματικές χρονιές. Επίσης, διαπιστώθηκε η ύπαρξη στατιστικά σημαντικής θετικής συσχέτισης μεταξύ του ποσοστού ριζοβολίας και του αριθμού και του μέσου μήκους των παραγόμενων ριζών των μοσχευμάτων με τη συγκέντρωσή τους σε άμυλο καθώς και με τη σχέση ολικοί μη δομικοί υδατάνθρακες προς άζωτο (μόνο το έτος 2005 για το μέσο μήκος) και στις δύο χρονιές. Κατά τον in vitro πολλαπλασιασμό της ξυλοκερατιάς έκφυτα, προερχόμενα από νεαρά σπορόφυτα, εγκαταστάθηκαν επιτυχώς, έπειτα από απολύμανση με 10% NaOCl για 12 λεπτά. Κατά το στάδιο της βλαστογένεσης, βρέθηκε πως τα έκφυτα της ξυλοκερατιάς έδειξαν καλύτερη ανταπόκριση (μεγάλος αριθμός και μέσο μήκος βλαστών ανά έκφυτο και μεγάλος αριθμό κόμβων ανά βλαστό) και συμπεριφορά στην ανάπτυξή τους (αποφυγή ξήρανσης κορυφής και νεκρώσεις στα φυλλάριά τους) στο θρεπτικό υπόστρωμα των Murashige και Skoog (MS). Επίσης, προέκυψε πως αύξηση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης είχε ως αποτέλεσμα αφενός την αύξηση του αριθμού των βλαστών ανά έκφυτο καθώς και του κάλλου και αφετέρου τη μείωση του μέσου μήκους των βλαστών ανά έκφυτο καθώς και του αριθμού των κόμβων ανά βλαστό. Η βενζυλαδενίνη (ΒΑ) έδωσε, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση, μεγαλύτερο αριθμό βλαστών ανά έκφυτο, σε σύγκριση με την 2-ισοπεντυλαδενίνη (2iP). Όμως, η 2iP έδωσε, για την ίδια συγκέντρωση, μεγαλύτερο αριθμό κόμβων ανά βλαστό, σε σύγκριση με τη ΒΑ. Στο στάδιο της ριζοβολίας, η χρησιμοποίηση μεθόδου δύο σταδίων έδωσε υψηλά ποσοστά ριζοβολίας στα έκφυτα της ξυλοκερατιάς. Ως καλύτερη επέμβαση είναι δυνατό να θεωρηθεί ο συνδυασμός 1 mg L⁻¹ IBA και χρόνου παραμονής 10 ημερών των εκφύτων στο ΙΒΑ, καθώς έδωσε, μετά από συνολική παραμονή τριών εβδομάδων των εκφύτων στο θάλαμο ανάπτυξης, υψηλό ποσοστό ριζοβολίας (95%), ικανοποιητικό αριθμό ριζών (σχεδόν 6 ρίζες ανά έκφυτο), σχετικά μεγάλο μέσο μήκος ριζών (1,8 cm) και μικρό κάλλο. Τα έρριζα έκφυτα, μετά την ολοκλήρωση του σταδίου του εγκλιματισμού και της σκληραγώγησής τους, παρουσίασαν υψηλά ποσοστά επιβίωσης, περίπου 90%. Συμπερασματικά, η ξυλοκερατιά πολλαπλασιάζεται με επιτυχία με φυλλοφόρα μοσχεύματα καθώς και in vitro. Η χρησιμοποίηση φυτικού υλικού, που βρίσκεται στη φάση της νεανικότητας, είχε θετική επίδραση στον πολλαπλασιασμό της τόσο με φυλλοφόρα μοσχεύματα, καθώς έδωσε υψηλά ποσοστά ριζοβολίας, μεγάλο αριθμό και μέσο μήκος ριζών, όσο με την in vitro τεχνική, καθώς επέτρεψε την εγκατάσταση της καλλιέργειας χωρίς ιδιαίτερα προβλήματα. Η χρησιμοποίηση φυτορυθμιστικών ουσιών είχε θετική επίδραση στον πολλαπλασιασμό της και με τις δύο τεχνικές, ενώ η απομόνωση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και ο προσδιορισμός βιοχημικών παραγόντων στους βλαστούς της βοήθησε στην ερμηνεία του πολλαπλασιασμού της, με φυλλοφόρα μοσχεύματα.