Ανοσολογικές αποκρίσεις πεπτιδικών αναλόγων της μυελίνης συζευγμένα με μαννάνη ή αναμεμειγμένα με ανοσοενισχυτικό CFA σε πειραματικά μοντέλα της σκλήρυνσης κατά πλάκας

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a commonly occurring chronic, inflammatory and disabling disorder of the central nervous system (CNS). It is widely considered that CD4+ T helper type 1 (Th1) cells play a pivotal role in mediating an autoimmune attack against components of myelin sheath. Additional cells, such as CD8+ T cells, macrophages and complement are also involved in axonal damage and neurodegeneration. Several autoantigens, such as myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP) and myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) have been proposed as candidate antigens in the induction of MS based on auto-T cells and auto-antibodies which are present in patients with MS. The design of peptide mutants of disease-associated myelin epitopes to alter immune responses from Th1 to Th2 offers a promising avenue for the treatment of MS. Hence, a number of peptides were designed and synthesised by mutating principal TCR contact residues based on MBP87-99, MBP83-99 and PLP139-151 peptide epitopes in their linear or cyclic forms. Peptides were either emulsified in equal volumes of complete Freund’s adjuvant (CFA) and phosphate buffer saline (PBS) or conjugated to reduced mannan via a KLH linker, in order to examine their cytokine and antibody profile. Mannan was previously found to generate either a Th1 response (IL-2, IFN-γ,? IL-12, TNF-α and IgG2a antibodies) or Th2 response (not IFN-γ or IL-12, but significant amounts of IL-4, IL-10 and TGF-β and IgG1 antibodies) depending on the mode of conjugation, oxidised or reduced mannan, respectively. IFN-γ, IL-4 and IL-10 or antagonism experiments were conducted using a capture ELISpot method, proliferation assays were performed to evaluate the regulation of the peptides in vitro and ELISA was performed to assess antibody responses in vivo. We noted that the use of CFA with either MBP87-99 or MBP83-99 mutant peptide analogues, in general, for immunisation, induced higher levels of IFN-γ and lower levels of IL-4, when mutant analogues were used. However, very high levels of IL-4 and IL-10 and no IFN-γ were secreted by T cells, when mice were immunised with reduced mannan peptide conjugates. Antibody responses to native peptide, mutant peptides, linear and cyclic peptides and to whole MBP protein, in addition to, T cell proliferation and EAE experiments were also been assessed. Overall, the linear [Y91]MBP83-99 peptide conjugated to reduced mannan showed the best cytokine and antibody profile and could antagonise T cell responses in vitro, thus, gives promise for the immunotherapy of MS and needs to be pursued for further testing in human studies. For the first time, structural alignment of existing crystal structures revealed the peptide binding motif of H2 I-As (MHC class II). Molecular modelling was used to identify novel H-bonds and van der Waals interactions between peptides and MΗC (I-As). Finally, mannosylation of PLP139-151 peptide could protect mice from EAE in a prophylactic vaccination setting.

Η σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια χρόνια, φλεγμονώδης και εκφυλιστική νόσος του κεντρικού νευρικού συστήματος. Πιστεύεται ότι οφείλεται σε εξειδικευμένα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα (Th1) τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην επίθεση κατά της μυελινικής θήκης. Η νόσος χαρακτηρίζεται επίσης από τοπικά CD8+ Τ λεμφοκύτταρα, διηθημένα μακροφάγα, περιαγγειακή φλεγμονή, εστίες απομυελίνωσης και απώλειες νευρολογικής λειτουργίας. Διάφορα αυτο-αντιγόνα, όπως η βασική πρωτεΐνη της μυελίνης (MBP), η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της μυελίνης (PLP) και η μυελινική γλυκοπρωτεΐνη των ολιγοδενδριτών (MOG), έχουν προταθεί ως υποψήφια αντιγόνα για την πρόκληση της ΣΚΠ, αφού T κύτταρα ειδικά για MBP, PLP ή MOG και αυτοαντισώματα έχουν ανιχνευθεί σε αίμα ή εγκεφαλονωτιαίο υγρό ασθενών. Πολλές μελέτες έχουν σχεδιάσει και χρησιμοποιήσει τροποποιημένα πεπτιδικά ανάλογα (APL) της μυελινικής θήκης με στόχο να αλλάξουν την ανοσολογική απόκριση από Th1 σε Th2. Επομένως, σχεδιάστηκαν και συνετέθησαν διάφορα πεπτιδικά ανάλογα των επιτόπων MBP87-99, MBP83-99 και PLP139-151 (γραμμικά και κυκλικά), αλλάζοντας κύριες θέσεις πρόσδεσης με τον TCR. Σε αυτή τη μελέτη, τα πεπτιδικά ανάλογα αναμείχθηκαν με ανοσοενισχυτικό CFA ή συζεύχθηκαν με ανηγμένη μαννάνη μέσω φορέα KLH, με στόχο τη μελέτη κυτταρικής και χυμικής απόκρισης. Η μαννάνη ανάλογα αν είναι στην οξειδωμένη ή στην ανηγμένη μορφή της, οδηγεί σε έκκριση διαφορετικών κυτταροκινών. Συγκεκριμένα, αντιγόνα συζευγμένα με οξειδωμένη ή ανηγμένη μαννάνη προάγουν Th1 (IL-2, IFN-γ, IL-12, ΤΝF-α, IgG2α αντισώματα) ή Th2 (IL-4, IL-10, TGF-β, IgG1 αντισώματα) ανοσοαπόκριση, αντίστοιχα. Η έκκριση IFN-γ, IL-4, IL-10 ή πειράματα ανταγωνισμού μελετήθηκαν με πείραμα ELISpot, πειράματα Τ κυτταρικού πολλαπλασιασμού μελέτησαν τη δράση των πεπτιδίων in vitro και χρησιμοποιήθηκε μέθοδο ELISA για την μέτρηση αντισωμάτων έναντι των πεπτιδίων. Η χρήση CFA για ανοσοποίηση των τροποποιημένων πεπτιδικών αναλόγων προκάλεσε έκκριση υψηλότερων επιπέδων IFN-γ και μεσαία ή χαμηλά επίπεδα IL-4. Σε αντίθεση, τροποποιημένα πεπτίδια συζευγμένα σε ανηγμένη μαννάνη προκάλεσαν παραγωγή υψηλών επιπέδων IL-4, IL-10 και καθόλου IFN-γ, αλλάζοντας την ανοσολογική απόκριση από Th1 σε Th2. Επίσης, μελετήθηκαν χυμικές αποκρίσεις έναντι των αγωνιστών, των τροποποιημένων πεπτιδικών αναλόγων (γραμμικών και κυκλικών), έναντι ολόκληρης της MBP πρωτεΐνης, Τ κυτταρικός πολλαπλασιασμός των πεπτιδικών αναλόγων και η αποτελεσματικότητα τους σε πειράματα ΕΑΕ. Το γραμμικό [Υ91]MBP83-99 πεπτιδικό ανάλογο συζευγμένο με ανηγμένη μαννάνη έδειξε την καλύτερη κυτταρική, χυμική ανοσοαπόκριση και μπόρεσε να ανταγωνιστεί Τ κυτταρικές αποκρίσεις in vitro και φαίνεται να αποτελεί το καλύτερο ανάλογο ως υποψήφιο για την ανοσοθεραπεία της ΣΚΠ και θα μελετηθεί περαιτέρω. Ο μοριακός σχεδιασμός των τροποποιημένων πεπτιδικών αναλόγων βοήθησε στην καλύτερη κατανόηση των δεσμών υδρογόνου και των αλληλεπιδράσεων van der Waals ανάμεσα στα πεπτίδια με το MHC τάξης ΙΙ (I-As). Τέλος, ανοσοποίηση με το PLP139-151 πεπτιδικό ανάλογο συζευγμένο με οξειδωμένη ή ανηγμένη μαννάνη προστάτευσε τα ζώα από την ΕΑΕ, χρησιμοποιώντας προφυλακτικό πείραμα ανοσοσοποίησης