Μελέτη της αποδόμησης τοξικών ουσιών με λιγνινολυτικούς μύκητες

Abstract

The scope of this study was the characterization of new strains that produce high ligninolytic activities for their potential use in bioremediation applications. Most of the strains were supplied by the ATHUM collection of mycetes from the University of Athens and additionally a few strains were isolated in pure culture in our laboratory. These strains were screened using the standard decolourisation method of Poly R-478, due to its correlation with the ligninolytic degradation activity and the decolourisation of the dye. Grounded on the growth rates in Petri dishes in an appropriate medium, the decolourisation ability and tolerance against two pesticides (PCP and Lindane), eight fungi were selected for further research. To determine the effect of nitrogen as a nutrient to decolourisation in the solid medium BM, two different concentrations of asparagine were used. Then, the ability of eight strains of fungi to decolourise the polymeric dye, Poly R-478, was studied in liquid cultures. The purpose was to evaluate the decolourisation potential of the selected fungal strains in different conditions. To determine the effect of nitrogen content, decolourisation was examined in N- limited and N- rich cultures. Differences were revealed for the tested strains in their ability to decolourise the polymeric dye. The ligninolytic activities of selected strains were determined in a nitrogen-sufficient liquid medium. In order to determine the effect of temperature in ligninolytic activities, the white rot fungi were incubated in different cultivation temperatures (15, 20, 25 and 30 οC). The activities of manganese peroxidase and laccase were determined, but no lignin peroxidase was detected for all strains. Significant differences were revealed between strains of the same species. The polymerase chain reaction (PCR) was used to determine the presence of laccase, lignin and manganese peroxidase potential-producing abilities of fungi. According to available nucleotide sequences of genes from basidiomycetes, one known pair of primers for laccase, three pairs of primers for manganese peroxidase and one pair of primers for lignin peroxidase were used. Additionally, pair of primers for laccasse and two pairs of primers for manganese peroxidase were designed. Finally, it was studied the biodegradation capability of the organochlorine pesticide Lindane by the most effective strains, Pleurotus ostreatus and Ganoderma australe. The central composite design selected as a response surface methodology proved to be suitable for performing bioremediation studies in complex systems in which the growth of microorganisms in a hostile medium, the production of degradative enzymes by the microorganism, the toxicity of the pollutant to the microorganism, the heterogeneity of the system’s components and other factors do not permit a straightforward study. The strains removed Lindane effectively in liquid agitated cultures and their application to bioremediate Lindane contaminated liquid systems is thus a feasible option due to their removal capabilities.

Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη και ο χαρακτηρισμός νέων στελεχών μυκήτων με υψηλό λιγνινολυτικό δυναμικό για ενδεχόμενη χρήση σε εφαρμογές βιοεξυγίανσης. Από τα 22 στελέχη μυκήτων που εξετάσθηκαν, δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στους μύκητες που αναπτύσσονταν πάνω σε ξυλώδη υποστρώματα σε αποσύνθεση και χορηγήθηκαν κυρίως από τη Συλλογή μυκήτων ATHUM του Πανεπιστημίου Αθηνών ενώ κάποια στελέχη απομονώθηκαν στο εργαστήριο. Σε στερεές καλλιέργειες (τριβλύα Petri), υπολογίστηκε ο ρυθμός ανάπτυξης των επιλεγέντων μυκήτων σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο και σε συνδυασμό με τον αποχρωματισμό και την ανοχή σε δύο βιοκτόνα (PCP και Lindane), επιλέχθηκε μια μικρότερη ομάδα οκτώ μυκήτων για περαιτέρω μελέτη. Ο αποχρωματισμός της χρωστικής εξετάστηκε αρχικά στο στερεό μέσο ΒΜ με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις αζώτου. Η περιεκτικότητα του αζώτου επηρέασε τον αποχρωματισμό και μεγαλύτερες ικανότητες αποχρωματισμού παρατηρήθηκαν στη χαμηλή συγκέντρωση αζώτου. Η ικανότητα αποχρωματισμού της χρωστικής από τους μύκητες αποτιμήθηκε και σε υγρές καλλιέργειες. Από τα αποτελέσματα προέκυψαν διαφορές ανάμεσα στους εξεταζόμενους μύκητες, όσον αφορά την ικανότητα τους να αποχρωματίζουν τη πολυμερική χρωστική ουσία κάτω από διάφορες συνθήκες καλλιέργειας και προέκυψε η ενδεχόμενη χρήση των μυκήτων λευκής σήψης σε αποχρωματισμούς βαφικών υλών. Επίσης, προσδιορίστηκαν οι ενζυμικές δραστικότητες των λιγνινολυτικών ενζύμων των πιο αποτελεσματικών στελεχών. Οι ενζυμικές δραστικότητες έδειξαν ότι ο συνδυασμός λακκάσης και υπεροξειδάσης του μαγγανίου επικράτησε σε όλα τα στελέχη, ενώ η υπεροξειδάση της λιγνίνης δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα μύκητα. Τελικός έλεγχος του λιγνινολυτικού δυναμικού των υπό εξέταση μυκήτων, έγινε με τον εντοπισμό των γονιδίων που εκφράζουν τα λιγνινολυτικά ένζυμα με την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR). Χρησιμοποιήθηκε ένα ζεύγος γνωστών εκκινητών από τη βιβλιογραφία για την ανίχνευση του γονιδίου της λακκάσης, τρία ζεύγη εκκινητών για την υπεροξειδάση του μαγγανίου και ένα ζεύγος εκκινητών για την υπεροξειδάση της λιγνίνης. Επίσης, σχεδιάστηκε ένα ζεύγος εκκινητών για την λακκάση και δύο ζεύγη εκκινητών για την υπεροξειδάση του μαγγανίου. Τέλος, μελετήθηκε η ικανότητα αποδόμησης του οργανοχλωριωμένου φυτοφαρμάκου Lindane από τα δύο πιο αποτελεσματικά στελέχη, τα Pleurotus ostreatus και Ganoderma australe. Με σκοπό την αριστοποίηση του μέσου και των συνθηκών για μια αποτελεσματική αποδόμηση, εφαρμόστηκε ένα ορθογώνιος σύνθετος κεντρικός σχεδιασμός πειραμάτων. Τα στελέχη ήταν αποτελεσματικά στην απομάκρυνση του Lindane στις υγρές καλλιέργειες και η εφαρμογή τους σε υγρά συστήματα ρυπασμένα με Lindane αποτελεί συνεπώς μια εφικτή επιλογή.