Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός δειγμάτων αμύλου προερχόμενων από διάφορα δημητριακά με την τεχνική της μονοφασικής χρωματογραφίας πεδίου

Abstract

Field Flow Fractionation (FFF) was applied for the analysis and the physicochemical characterization of starch granules emanating from various cereals. The source of origin of the sample and the dispersing medium of this constitute the decisive factors for the size and mass distribution of the starch granules. It was realised that the starch from barley presents either a trinomial or a bimodal distribution of the size of the particles depending on the variety of the origin. When the starch sample emanates from wheat, the starch granules present binomial size distribution, while the starch from maize presents a size distribution with big deviation. These observations are found in complete agreement with bibliographic reports. After that, and selecting to analyse a wheat starch sample, was studied the change of the average mass and number diameters, as well as the mass distribution of starch granules, concerning the dispersing medium of the sample that was used. Each time was altered either the pH, or the ionic strength of the dispersing medium. Were selected these two parameters, because their change influences immediately the potential energy of interaction not only between starch granules, but also between them and the channel wall of the FFF system that was used. Moreover, their values can easily be determined and altered experimentally. It was realised that in pH=7 - 11 of the dispersing medium, was caused no change in the size and mass distribution of starch granules. In pH<7 we cannot have reliable results, provided that the isoelectric point of the column is found to be in pH = 5.5 and influences drastically the particle - wall interactions. Maintaining the pH value of the dispersing medium constant and roughly equal to 9.5, we increase progressively the ionic strength with addition of suitable electrolyte. We observe that is caused reduction of mass percentage of the starch granules of small size with simultaneous corresponding increase of mass percentage of big granules. This means that the increase of the ionic strength of the dispersing medium leads to aggregation of starch granules of small size. The stability of the starch sample is influenced drastically by the presence or not and the nature of the surfactant in the dispersing medium. Thus, we studied the behaviour of the initial wheat starch sample and two fractions of the granules of the initial sample that resulted from application of SPLITT method in the initial sample. We proved that the absence of surfactant from the dispersing medium has as result the aggregation of small starch granules, which entails the reduction of the mass percentage of these particles. However, when the dispersing medium contains any surfactant, the nature of this has decisive importance. The most reliable results were received at the presence in the dispersing medium of the surfactant FL -70, a mix of anionic and non-ionic groups, as no phenomena of aggregation or adhesion of the starch granules in this case were observed. The use of Triton X -100, a non-ionic surfactant, causes phenomena of detention of starch granules in the interior of the column, as indicates the reduction of the average mass and number diameters of the starch granules. SDS, because of its strong anionic character, was judged as inadequate for the analysis of starch samples with SdFFF according to the results that we received after its use for the calculation of size and mass distribution of starch granules. For confirmation of these results, barley starch sample dispersed in a medium which contained SDS, was analyzed apart from the technique of SdFFF also with the AsFlFFF technique. Both these two individual techniques of FFF led to the same experimental results, the reject of SDS as a surfactant for the analysis of starch samples with the methodology of FFF. For reasons of comparative study, our samples were also analyzed with other techniques, as the Scanning Electron Microscopy and the Laser Scattering Technique, while the surface potential of starch granules was measured with a microelectrophoresis apparatus. The results that were received were in complete agreement with those of FFF, rendering FFF as a fast, easy and reliable methodology for the analysis and physicochemical characterization of starch samples emanating from various cereals.

Η Μονοφασική Χρωματογραφία Πεδίου (Μ.Χ.Π.) εφαρμόστηκε για την ανάλυση και το φυσικοχημικό χαρακτηρισμό σωματιδίων αμύλου προερχόμενο από διάφορα δημητριακά. Η πηγή προέλευσης του δείγματος και το μέσο διασποράς αυτού αποτελούν τους καθοριστικούς παράγοντες τόσο για την κατανομή μεγέθους των σωματιδίων αμύλου, όσο και για την κατανομή μαζών αυτών. Διαπιστώθηκε ότι το άμυλο από κριθάρι εμφανίζει άλλοτε τριωνυμική και άλλοτε δυωνυμική κατανομή μεγέθους σωματιδίων ανάλογα με την ποικιλία προέλευσης. Όταν το δείγμα αμύλου προέρχεται από σιτάρι, τα σωματίδια αμύλου εμφανίζουν δυωνυμική κατανομή μεγέθους, ενώ το άμυλο από καλαμπόκι εμφανίζει μία κατανομή μεγέθους με αρκετά μεγάλη διασπορά. Οι παρατηρήσεις αυτές βρίσκονται σε πλήρη συμφωνία και με βιβλιογραφικές αναφορές. Στη συνέχεια, και επιλέγοντας προς ανάλυση δείγμα αμύλου από σιτάρι, μελετήθηκε η μεταβολή των τιμών των μέσων μαζικών και μέσων αριθμητικών διαμέτρων, καθώς και της κατανομής μαζών των σωματιδίων του αμύλου σε σχέση με το μέσο διασποράς του δείγματος που χρησιμοποιήθηκε. Κάθε φορά μεταβάλλονταν είτε το pH, είτε η ιοντική ισχύς του μέσου διασποράς. Επιλέχθηκαν οι δύο αυτές παράμετροι, λόγω του ότι η μεταβολή τους επηρεάζει άμεσα τη δυναμική ενέργεια αλληλεπίδρασης των σωματιδίων αμύλου τόσο μεταξύ τους όσο και με το τοίχωμα της στήλης του συστήματος της Μονοφασική Χρωματογραφία Φυγοκεντρικού Πεδίου (ΜΧΦΠ)που χρησιμοποιήθηκε. Επιπλέον, η τιμή τους μπορεί εύκολα να προσδιοριστεί και να μεταβληθεί πειραματικά. Διαπιστώθηκε ότι σε pH = 7 - 11 του μέσου διασποράς δεν προκαλείται αλλαγή στην κατανομή μεγέθους και μαζών των σωματιδίων αμύλου. Σε pH<7 δεν μπορούμε να έχουμε αξιόπιστα αποτελέσματα, εφόσον το ισοηλεκτρικό σημείο της στήλης βρίσκεται σε pH = 5,5 και κατά συνέπεια μεταβάλλονται δραστικά οι αλληλεπιδράσεις σωματιδίων - στήλης. Διατηρώντας την τιμή του pH του μέσου διασποράς σταθερή και ίση περίπου με 9,5, αυξάνουμε σταδιακά την ιοντική ισχύ με προσθήκη κατάλληλου ηλεκτρολύτη. Παρατηρούμε ότι προκαλείται μείωση του ποσοστού της μάζας των σωματιδίων αμύλου μικρού μεγέθους με ταυτόχρονη αντίστοιχη αύξηση του ποσοστού της μάζας των μεγάλων σωματιδίων. Κατά συνέπεια, η αύξηση της ιοντική ισχύος του μέσου διασποράς οδηγεί σε συσσωμάτωση των σωματιδίων αμύλου μικρού μεγέθους. Η σταθερότητα του δείγματος αμύλου επηρεάζεται δραστικά από την παρουσία ή όχι και τη φύση της επιφανειοδραστικής ουσίας στο μέσο διασποράς. Έτσι, μελετήσαμε τη συμπεριφορά τόσο του αρχικού δείγματος αμύλου από σιτάρι, όσο και δύο άλλων δειγμάτων τα οποία αποτελούσαν κλάσματα μεγέθους του αρχικού δείγματος που προέκυψαν έπειτα από εφαρμογή στο αρχικό δείγμα της μεθόδου διαχωρισμού SPLITT. Αποδείξαμε ότι η έλλειψη επιφανειοδραστικής ουσίας από το μέσο διασποράς του δείγματος έχει ως αποτέλεσμα τη συσσωμάτωση των σωματιδίων αμύλου, οπότε και τη μείωση του επί τοις εκατό ποσοστού μαζών των σωματιδίων αυτών. Ωστόσο, όταν το μέσο διασποράς περιέχει κάποια επιφανειοδραστική ουσία, το είδος αυτής έχει καθοριστική σημασία. Τα πλέον αξιόπιστα αποτελέσματα ελήφθησαν κατά την παρουσία στο μέσο διασποράς της επιφανειοδραστικής ουσίας FL-70, ενός μίγματος ανιοντικών και μη ιοντικών συστατικών, καθώς φαινόμενα κατακράτησης ή συσσωμάτωσης των σωματιδίων αμύλου στην περίπτωση αυτή δεν παρατηρήθηκαν. Η χρήση Triton X-100, μιας μη ιοντικής επιφανειοδραστικής ουσίας, προκαλεί φαινόμενα κατακράτησης των σωματιδίων αμύλου στο εσωτερικό της στήλης, όπως άλλωστε υποδεικνύει η μείωση των τιμών των μέσων μαζικών και μέσων αριθμητικών διαμέτρων των σωματιδίων του αμύλου. Το SDS, λόγω του ισχυρού ανιοντικού χαρακτήρα του, κρίθηκε ως ακατάλληλο για την ανάλυση δειγμάτων αμύλου με την τεχνική της ΜΧΦΠ σύμφωνα με τα αποτελέσματα που λάβαμε κατά τη χρήση του για τον υπολογισμό της κατανομής μεγέθους και μαζών των σωματιδίων του αμύλου. Για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων αυτών, δείγμα αμύλου από κριθάρι διεσπαρμένο σε μέσο το οποίο περιείχε SDS, αναλύθηκε εκτός από την τεχνική της Μ.Χ.Φ.Π. και με την τεχνική της Μονοφασική Χρωματογραφία Πεδίου Ασύμμετρης Ροής (ΜΧΠ-ΑΡ) Και με τις δύο επιμέρους τεχνικές της ΜΧΠ καταλήξαμε στα ίδια πειραματικά αποτελέσματα οποία οδηγούν σε απόρριψη της χρήσης του SDS ως επιφανειοδραστικής ουσίας για την ανάλυση δειγμάτων αμύλου με την τεχνική της ΜΧΠ. Για λόγους συγκριτικής μελέτης, τα δείγματά μας αναλύθηκαν και με άλλες τεχνικές, όπως η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης και η Σκέδαση Ακτίνων Laser, ενώ το επιφανειακό δυναμικό των σωματιδίων του αμύλου μετρήθηκε με συσκευή μικροηλεκτροφόρησης. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν ήταν σε πλήρη συμφωνία με αυτά της ΜΧΠ, καθιστώντας έτσι τη ΜΧΠ μια γρήγορη, εύκολη και αξιόπιστη μέθοδο για το φυσικοχημικό χαρακτηρισμό σωματιδίων αμύλου προερχόμενο από διάφορα δημητριακά.