ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ ΤΟΥ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΦΥΤΟ CYNODON DACTYLON (L) PERS.

Abstract

PYRUVATE KINASE (PK,ATP PYRUVATE PHOSPHOTRANSFERASE, EC 2.7.1.40) IS A KEY REGULATORY ENZYME OF THE GLYCOLYTIC PATHWAY, CATALYZING THE IRREVERSIBLE CONVERSION OF PEP AND ADP TO PYRUVATE AND ATP, RESPECTIVELY. RESEARCH UNTIL TODAY WASFOCUSED MAINLY ON THE ENZYME FROM TISSUES OF C3 PLANTS AND OF GREEN ALGAE. THERE ARE NO AVAILABLE DATA ON THE PURIFICATION AND THE PHYSICAL, KINETIC AND REGULATORY PROPERTIES OF THE ENZYME FROM C4 PLANTS. THIS STUDY PRESENTS A NEW METHODOLOGY THAT ESTABLISHES OPTIMAL EXTRACTION AND ASSAY CONDITIONS OF PK FROM LEAVES OF THE C4 PLANT CYNODON DACTILON (L) PERS.THIS PREPARATIVE METHODOLOGY FACILITATES THE STUDY OF PK FROM THIS PLANT AS WELL AS FROM OTHER C4 PLANTS,ELIMINATING THE INTERFERENCE OF PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE AND PHOSPHATASE ACTIVITIES BY ACID INACTIVATION AND AMMONIUM MOLYBDATE,RESPECTIVELY.FURTHERMORE,THERMAL TREATMENT (57 C) OF THE CRUDE EXTRACT RESULTED IN AN ADDITIONAL 68% INACTIVATION OF THE ACID- INACTIVATED INTERFERING ENZYMES AND,ALSO,INCREASED THE PURITY OF PK BY 3.3-FOLD.THIS STUDY ALSO PRESENTS THE FIRST EVER PURIFICATION TO APPARENT HOMOGENEITY OF PK FROM A C4 PLANT. PK FROM LEAVES OF C. DACTYLON WAS PURIFIED 56-FOLD BY POLYETHYLENE GLYCOL FRACTIONATION AND CHROMATOGRAPHY INCLUDING Q-SEPHAROSE ANION EXCHANGER,ADP-AGAROSE AND GEL (ABSTR.TRUNC) XTRACTION AND ASSAY CONDITIONS OF PK FROM LEAVES OF THE C4 PLANT CYNODON DACTYLON (L) PERS.THIS PREPARATIVE METHODOLOGY FACILITATES THE STUDY OF PK FROM THIS PLANT AS WELL AS FROM OTHER C4 PLANTS,ELIMINATING THE INTERFERENCE

Η ΚΙΝΑΣΗ ΤΟΥ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΟΥ (ΡΚ,ΑΤP:PYRUVATE PHOSPHOTRANSFERASE,EC 2.7.1.40) ΕΙΝΑΙ ΕΝΑ ΕΝΖΥΜΟ-ΚΛΕΙΔΙ ΓΙΑ ΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΛΥΚΟΛΥΣΗΣ, ΚΑΤΑΛΥΟΝΤΑΣ ΤΗ ΜΗ ΑΝΤΙΣΤΡΕΠΤΗ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΤΟΥ ΡΕΡ ΚΑΙ ΤΟΥ ΑDΡ ΠΡΟΣ ΠΥΡΟΣΤΑΦΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΑΤΡ,ΑΝΤΙΣΤ. ΟΙ ΜΕΧΡΙ ΣΗΜΕΡΑ ΕΡΕΥΝΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΖΟΝΤΑΝ ΣΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΑΠΟ ΙΣΤΟΥΣ C3 ΦΥΤΩΝ ΚΑΙ ΑΠΟ ΦΩΤΟΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΦΥΚΗ. ΔΕΝ ΥΠΑΡΧΟΥΝ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΑΠΟ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΕΣ ΕΡΕΥΝΕΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟΝΚΑΘΑΡΙΣΜΟ,ΤΙΣ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ, ΚΙΝΗΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥΑΠΟ C4 ΦΥΤΑ. Η ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΛΕΤΗ, ΚΑΤΑ ΠΡΩΤΟΝ,ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΕΙ ΜΙΑ ΝΕΑ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΗ ΟΠΟΙΑ ΒΕΛΤΙΩΝΕΙ ΤΙΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ ΤΗΣ ΡΚ ΑΠΟ ΦΥΛΛΑ ΤΟΥ C4 ΦΥΤΟΥ CYNODON DACTYLON (L) PERS.ΑΥΤΗ Η ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΔΙΕΥΚΟΛΥΝΕΙ ΤΗΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΡΚ ΑΠΟ ΤΟ ΦΥΤΟ ΑΥΤΟ ΚΑΘΩΣ ΕΠΙΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟ ΑΛΛΑ C4 ΦΥΤΑ,ΕΛΑΧΙΣΤΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΤΗΝ ΠΑΡΕΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΤΟΥ ΡΕΡ ΚΑΙ ΤΩΝ ΦΩΣΦΑΤΑΣΩΝ ΤΟΥ ΡΕΡ ΜΕΣΩΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΛΟΓΩ ΟΞΙΝΟΥ ΡΗ ΚΑΙ ΜΟΛΥΒΔΑΙΝΙΚΟΥ ΑΜΜΩΝΙΟΥ, ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΑ. ΕΠΙΠΛΕΟΝ, Η ΘΕΡΜΙΚΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ (ΣΤΟΥΣ 57 C) ΤΟΥ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΠΡΟΚΑΛΕΣΕ ΚΑΤΑ 68% ΠΡΟΣΘΕΤΗ ΑΠΟΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΑΥΞΗΣΕ ΚΑΤΑ 3,3 ΦΟΡΕΣ ΤΗΝ ΚΑΘΑΡΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ. ΚΑΤΑ ΔΕΥΤΕΡΟΝ, Η ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΕΙ ΤΟΝ ΠΡΩΤΟ ΜΕΧΡΙ ΟΜΟΙΟΓΕΝΕΙΑΣ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟ ΡΚ ΑΠΟ C4 ΦΥΤΟ. Η ΡΚΑΠΟ ΤΑ ΦΥΛΛΑ ΤΟΥ C DACTYLON ΚΑΘΑΡΙΣΤΗΚΕ 56 ΦΟΡΕΣ ΜΕΣΩ ΚΛΑΣΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕ PEG ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΕΣ Q-SEPFAROSE, ADP-ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ. (ΠΕΡΙΚΟΠΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗΣ).