H σημασία των μηχανισμών μετά-μεταφραστικής τροποποίησης πρωτεϊνών για την κυτταρική απόκριση στην υποξία και την εμπλοκή της στην καρκινογένεση

Abstract

Hypoxia (oxygen deprivation) is a typical aspect of solid tumors and evokes changes that promote cancer, mainly by activating a small family of transcriptional activators called Hypoxia Inducible Factors (HIFs). HIFs have indeed been associated with tumorigenesis and are, therefore, considered valid targets of anticancer therapy. The oxygen-sensitive HIF-α subunit is additionally controlled by mechanisms involving phosphorylation. Although several kinases are known to regulate HIF-α, the corresponding counteracting phosphatases remain so far unknown.The first part of this thesis concerns the identification of phosphatases that regulate HIF activity. A phosphatome siRNA screening was performed and revealed that two phosphatases, PPP3CA (calcineurin), a calcium-dependent phosphatase, and PDP1 (Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase 1), an activator of pyruvate dehydrogenase, affect HIF- dependent transcriptional activity in HeLa cells under hypoxia (1% O2). Additional experiments showed that PPP3CA inhibits HIF activity, since its overexpression or its activation by ionomycin reduced HIF transcriptional activity under hypoxic conditions, without affecting HIF-α protein levels, HIF-1α subcellular localization or its association with HIF-1β. On the other hand, overexpression of PDP1, despite its localization in mitochondria, enhanced HIF-1 activity, which, probably through feedback inhibition, allowed preservation of the phosphorylation levels of PDH by HIF-1-dependent induction of PDK1. However, immunoprecipitation studies did not show any physical interaction between HIF-1α and PPP3CA or PDP1, suggesting that both phosphatases do not directly act on HIF-1α but regulate HIF activity indirectly.The second part of this thesis investigated the possibility to impair the adaptation of cancer cells to hypoxia using HIF-1α-derived peptides that inhibit its phosphorylation by ERK. Following previous studies by the Laboratory of Biochemistry (Faculty of Medicine, University of Thessaly) demonstrating that phosphorylation of HIF-1α by ERK1/2 at Ser641 and Ser643 stimulates HIF-1α activity by blocking its nuclear export, peptides containing the wild-type sequence of the HIF-1α ETD (ERK1/2-Targeted Domain, amino acids 616-658) or ETD forms carrying mutations that destroyed the ERK sites (ETD-SA) or mimicked phosphorylation be ERK (ETD-SE) or destroyed the HIF-1α nuclear export signal (ETD-IA) were designed, cloned, overexpressed in bacteria and purified. These peptides also contained an N-terminal HIV-derived TAT sequence, allowing penetration inside cells and a C-terminal Flag epitope, allowing their detection by specific antibodies. When these peptides were added in the culture medium of hepatocarcinoma Huh7 cells grown under hypoxia (1% O2), they entered the cells and all forms, except ETD-SA, were localized inside the nucleus, caused HIF-1α mislocalization to the cytoplasm, significantly reduced HIF-1 activity and impaired the induction of HIF-1 target genes, without, however, affecting the expression HIF-2 specific gene targets. Furthermore, the nuclear TAT-ETD peptides inhibited the metabolic adaptation, migration and colony formation of cancer cells and triggered their apoptotic death exclusively under hypoxia. Taken together, these data demonstrate the importance of ERK-mediated modification of HIF-1α for cancer cell survival under hypoxia and, in addition, suggest that cell-penetrating TAT-ETD peptides can be used as specific inhibitors of HIF-1 activity and HIF-1-dependent processes required for cellular adaptation to hypoxia and solid tumor growth.

Η υποξία (έλλειψη οξυγόνου) είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των στερεών όγκων και μέσω της ενεργοποίησης των επαγόμενων από την υποξία παραγόντων (HIF) προκαλεί προσαρμοστικές μεταβολές που προωθούν την εξέλιξη του καρκίνου. Οι HIF έχουν συσχετιστεί με την προαγωγή του καρκίνου και θεωρούνται ελκυστικοί στόχοι για την ανάπτυξη αντικαρκινικών θεραπειών. Οι εξαρτώμενες από το οξυγόνο υπομονάδες HIF-α ελέγχονται και από άλλους μηχανισμούς που βασίζονται στη φωσφορυλίωση. Παρόλο που αρκετές κινάσες έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν τους HIF-α, οι αντίστοιχες πιθανές φωσφατάσες που αντισταθμίζουν τη δράση τους παρέμεναν μέχρι τώρα άγνωστες.Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία διαλογής φωσφατασών με πειράματα αποσιώπησης μέσω siRNA, η οποία αποκάλυψε ότι οι φωσφατάσες ΡΡΡ3CΑ (καλσινευρίνη), που εξαρτάται από το ασβέστιο, και PDP1 (φωσφατάση της αφυδρογονάσης του πυροσταφυλικού 1), που αποφωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την πυροσταφυλική αφυδρογονάση (PDH), επηρεάζουν την ενεργότητα των HIF σε συνθήκες υποξίας (1% Ο2), σε καρκινικά κύτταρα HeLa. Αποδείχθηκε πειραματικά ότι η PPP3CA αναστέλλει τους HIF, καθώς η υπερέκφραση ή η ενεργοποίησή της με ιονομυκίνη μείωσε τη μεταγραφική ενεργότητα των HIF στην υποξία, χωρίς να μεταβάλλει τα πρωτεϊνικά επίπεδα των HIF-α, τον υποκυτταρικό εντοπισμό του HIF-1α ή τη σύνδεσή του με τον HIF-β. Αντίθετα, η υπερέκφραση της PDP1, παρά τον εντοπισμό της στα μιτοχόνδρια, αύξησε τη δράση του HIF-1 κατά την υποξία, γεγονός που επέτρεψε, πιθανόν μέσω αρνητικής ανατροφοδότησης, τη διατήρηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης της PDΗ εξαιτίας της επαγωγής της κινάσης PDK1 από τον HIF-1. Ωστόσο, σε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης δεν παρατηρήθηκε δημιουργία συμπλόκου μεταξύ του HIF-1α και της PPP3CA ή της PDP1, υποδεικνύοντας ότι οι δύο φωσφατάσες δε δρουν άμεσα στους HIF-α, αλλά ρυθμίζουν τη μεταγραφική δραστικότητα των HIF μέσω ενός έμμεσου μηχανισμού.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, μελετήθηκε ο ρόλος της φωσφορυλίωσης του HIF-1α από τις ERK1/2, μέσω της αναστολής του HIF-1 με τη χρήση πεπτιδίων που περιέχουν αμινοξικές αλληλουχίες του HIF-1α και μπορούν να εμποδίσουν τη φωσφορυλίωση του από τις κινάσες ERK1/2. Με βάση προηγούμενες μελέτες του Εργαστηρίου Βιοχημείας του Τμήματος Ιατρικής του Π.Θ., σύμφωνα με τις οποίες η φωσφορυλίωση του HIF-1α από τις ERK1/2 στα κατάλοιπα Ser641 και Ser643 αυξάνει τη δραστικότητά του παρεμποδίζοντας την εξαγωγή του από τον πυρήνα, έγινε σχεδίαση, κλωνοποίηση, υπερέκφραση σε βακτήρια και απομόνωση σε καθαρή μορφή πεπτιδίων που περιέχουν τη φυσική αλληλουχία της περιοχής ETD (ERK1/2 Targeted Domain, αμινοξέα 616-658) του HIF-1α ή μορφές της ETD που έφεραν μεταλλάξεις που καταστρέφουν τις θέσεις φωσφορυλίωσης από τις κινάσες ERK1/2 (ETD-SA) ή μιμούνται τη φωσφορυλίωση αυτή (ETD-SE) ή καταστρέφουν το σήμα πυρηνικής εξαγωγής του HIF-1α (ETD-ΙΑ). Τα πεπτίδια αυτά έφεραν επίσης στο αμινοτελικό τους άκρο την αλληλουχία ΤΑΤ του ιού ΗIV, που προσδίδει ικανότητα διείσδυσης στα κύτταρα, και στο καρβοξυτελικό τους άκρο τον επίτοπο Flag, που επιτρέπει την ανίχνευσης τους με ειδικό αντίσωμα. Όταν τα πεπτίδια αυτά προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων ηπατοκαρκινώματος Huh7 σε συνθήκες υποξίας (1% Ο2), εισήλθαν στο εσωτερικό των κυττάρων, και όλα, εκτός από το ETD-SA, συσσωρεύτηκαν στον πυρήνα, προκάλεσαν τη μετατόπιση του ενδογενούς HIF-1α στο κυτταρόπλασμα, μείωσαν τη μεταγραφική δραστικότητα του HIF-1 και εμπόδισαν την έκφραση γονιδίων-στόχων του HIF-1, χωρίς όμως να επηρεάσουν την έκφραση γονιδίων-στόχων του HIF-2. Επίσης τα πεπτίδια TAT- ETD που εντοπίζονται στον πυρήνα ανέστειλαν τη μεταβολική προσαρμογή, τη μετανάστευση και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των καρκινικών κυττάρων και αύξησαν το θάνατό τους ενεργοποιώντας την απόπτωση, αποκλειστικά κάτω από συνθήκες υποξίας. Τα δεδομένα αυτά αποδεικνύουν τη σημασία της φωσφορυλίωσης του HIF-1α από τις κινάσες ERK1/2 για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες υποξίας και επιπλέον, προτείνουν τη χρήση των κυτταροδιεισδυτικών πεπτιδίων ΤΑΤ-ETD ως έναν αποτελεσματικό τρόπο για την ειδική αναστολή της δράσης του HIF-1 και των εξαρτώμενων από τον HIF-1 βιολογικών λειτουργιών, που επιτρέπουν τόσο την κυτταρική προσαρμογή στη υποξία, όσο και την ανάπτυξη των στερεών όγκων.