Ο ρόλος του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα HIF-2α στην κυτταρική λειτουργία

Abstract

Hypoxia inducible factor HIF-2 is a transcriptional activator that mediates the cellular response to hypoxia. It is involved in physiological processes like development and differentiation, but also in pathological situations like cancer and inflammation. It acts as a heterodimer complex that consists of a hypoxia inducible subunit (HIF-2α) and a constitutively expressed subunit HIF-1β or ARNT. Regulation of HIF-2α involves oxygen-independent mechanisms, including post-translational modifications.In the first part of this thesis, we investigated the phosphorylation of HIF-2α by the casein kinase 1δ (CK1δ). We demonstrate that CK1δ phosphorylates HIF-2α at Ser383 and Thr528 in vitro. Disruption of these phosphorylation sites and silencing or chemical inhibition of CK1δ reduced the transcriptional activity of HIF-2 and the secretion of erythropoietin (EPO) in the two hepatic cancer cell lines tested, Huh7 and HepG2. Phosphorylation of Ser383 and Thr528 did not affect the protein stability of HIF-2α or its interaction with the specific co-activator USF2. However, immunofluorescence and subcellular localization assays showed that when CK1δ-dependent phosphorylation of HIF-2α was inhibited, we observed significant cytoplasmic mislocalization of HIF-2α. More strikingly, nuclear accumulation was re-established when nuclear protein export was inhibited upon addition of the CRM1 inhibitor Leptomycin B (LMB), suggesting that phosphorylation by CK1δ is required to maintain HIF-2α inside the nucleus where it gains access to its target genes, through inhibition of its CRM1 dependent nuclear export. Taken together these data suggest that CK1δ enhances EPO secretion from liver cancer cells under hypoxia by modifying HIF-2α and promoting its nuclear accumulation. The identification of this new oxygen-independent regulatory mechanism of HIF-2α could represent a potent therapeutic target in pathological situations that involve hypoxia and HIF-2. Considering the complicated relationship that exists between chronic inflammation and cancer in the development of hepatocellular carcinoma (HCC), in the second part of this thesis, we analyzed the effect of the pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 και IL-1β on HIF-2α, in comparison to the corresponding effect on HIF-1α in liver cancer cells. Our results showed that HIF-1α protein levels were increased in response to IL-1β and that its protein levels as well as its transcriptional activity were also augmented by IL-6 under hypoxia. However, HIF-2α was not influenced by the above cytokines at any level. TNF-α was found to act as a discriminating factor of the two HIF isoforms, since it activated the transcription of specific HIF-1 target genes like PGK, whereas it deactivated the transcription of specific HIF-w target genes like SOD2 and EPO. Immunofluorescence assays indicated that HIF-2α was significantly mislocalized to the cytoplasm in response to TNF-α and that this phenomenon was partially reversed upon Leptomycin B (LMB) treatment. Overall these data suggest that enhanced CRM1-mediated nuclear export is one of the reasons that could explain the observed HIF-2 partial inactivation under combined conditions of hypoxia and TNF-α in the Huh7 hepatocellular cancer cell line. However, we cannot exclude the possibility of other molecular mechanisms playing a role in this regulation, the clarification of which would contribute to better therapeutic strategies regarding the inflammation driven liver carcinogenesis.

Ο HIF-2 αποτελεί μέλος της οικογένειας των επαγόμενων από την υποξία μεταγραφικών παραγόντων και είναι ένας από τους βασικούς ρυθμιστές της κυτταρικής απόκρισης στην υποξία. Εμπλέκεται σε φυσιολογικές καταστάσεις όπως η ανάπτυξη και η διαφοροποίηση, αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος και η φλεγμονή. Δρα ως ετεροδιμερές σύμπλοκο που αποτελείται από μια επαγόμενη από την υποξία υπομονάδα (HIF-2α) και μια συνεχώς εκφραζόμενη υπομονάδα HIF-1β ή ARNT. Η HIF-2α υπομονάδα ρυθμίζεται από οξυγόνο-ανεξάρτητους μηχανισμούς καθώς και από μετά-μεταφραστικές τροποποιήσεις οι οποίοι δεν έχουν επαρκώς διαλευκανθεί. Το πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής επικεντρώθηκε στη μελέτη της ρύθμισης του HIF-2 μέσω φωσφορυλίωσης από την κινάση της καζεΐνης CK1δ. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η CK1δ φωσφορυλιώνει τον HIF-2α στα αμινοξικά κατάλοιπα Ser383 και Thr528 in vitro. Η κατάργηση της φωσφορυλίωσης στις παραπάνω θέσεις μέσω στοχευμένης μεταλλαξιγένεσής τους σε Ala, καθώς και η αποσιώπηση ή η αναστολή της κινάσης, μείωσαν τη μεταγραφική δράση του HIF-2 και την εξαρτώμενη από τον HIF-2 έκκριση ερυθροποιητίνης (EPO) στις δύο ηπατοκαρκινικές σειρές που εξετάστηκαν, Huh7 και HepG2. Η φωσφορυλίωση των Ser383 και Thr528 δεν παρατηρήθηκε να επηρεάζει την πρωτεϊνική σταθερότητα του HIF-2α ή την αλληλεπίδρασή του με τον εξειδικευμένο μεταγραφικό συμπαράγοντα USF2. Ωστόσο, έπειτα από πειράματα ανοσοφθορισμού και υποκυτταρικής κλασμάτωσης, παρατηρήθηκε ότι η αναστολή της φωσφορυλίωσης του HIF-2α από την CK1δ οδήγησε ένα σημαντικό ποσοστό της HIF-2α υπομονάδας στο κυτταρόπλασμα. Το φαινόμενο αυτό αντιστράφηκε παρουσία του εξειδικευμένου αναστολέα της εξπορτίνης CRM1, λεπτομυκίνης β (LMB), υποδεικνύοντας ότι η φωσφορυλίωση από την CK1δ είναι απαραίτητη προκειμένου ο HIF-2α να διατηρείται μέσα στον πυρήνα και να έχει πρόσβαση στα γονίδια-στόχους του. Συμπερασματικά, προτείνεται ότι η CK1δ ενισχύει την έκκριση της EPO σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος, μετά από άμεση φωσφορυλίωση του HIF-2α και συσσώρευσή του στον πυρήνα. Η ταυτοποίηση αυτού του νέου μηχανισμού ρύθμισης του HIF-2α θα μπορούσε να αποτελέσει θεραπευτικό στόχο σε παθολογικές καταστάσεις όπου εμπλέκεται η υποξία και o HIF-2.Δεδομένης της πολύπλοκης σχέσης που υπάρχει μεταξύ υποξίας και χρόνιας φλεγμονής στη εξέλιξη του ηπατοκαρκινώματος (HCC), στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής, μελετήθηκε η ρύθμιση του HIF-2 υπό την επίδραση των προ-φλεγμονωδών παραγόντων TNF-α, IL-6 και IL-1βκαι συγκρίθηκε με την αντίστοιχη ρύθμιση του HIF-1α σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος, Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η IL-1β αυξάνει τα πρωτεϊνικά επίπεδα του HIF-1α και ότι η IL-6 προκαλεί αύξηση τόσο της πρωτεΐνης όσο και της δράσης του HIF-1σε συνθήκες υποξίας. Αντίθετα καμία από τις παραπάνω κυτταροκίνες δεν επηρεάζει τον HIF-2 σε κανένα επίπεδο. Ενώ, οTNF-α διαφαίνεται να δρα ως διακριτός ρυθμιστής των ισομορφών HIF καθώς επάγει ειδικούς μεταγραφικούς στόχους του HIF-1 όπως η PGK1, ενώ αναστέλλει την επαγωγή ειδικών μεταγραφικών στόχων του HIF-2 όπως η SOD2 και η EPO, αναστέλλοντας παράλληλα και την έκκριση της EPO. Πειράματα ανοσοφθορισμού υπέδειξαν ότι ο HIF-2α,παρουσία του TNF-α, εντοπίζεται σε μεγάλο ποσοστό στο κυτταρόπλασμα, με το φαινόμενο αυτό να αντιστρέφεται μερικώς όταν στα κύτταρα προστίθεται λεπτομυκίνη β (LMB). Συμπερασματικά, στο δεύτερο αυτό μέρος της διατριβής, προτείνεται ότι η μερική απενεργοποίηση του HIF-2 παρουσία του TNF-α σε συνθήκες υποξίας στα κύτταρα ηπατοκαρκινώματος Huh7, είναι η ενισχυμένη έξοδός του από τον πυρήνα μέσω της εξπορτίνης CRM1 χωρίς να αποκλείεται η συμμετοχή και άλλων μοριακών συντελεστών, η διερεύνηση των οποίων θα μπορούσε να συμβάλλει στη δημιουργία νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων όσον αφορά στην σχετιζόμενη με τη φλεγμονή καρκινογένεση στο ήπαρ.