Η ανίχνευση του ιού του ανθρώπινου θηλώματος (PHV) σε ασθενείς με καρκίνο ουροδόχου κύστεως με τη μέθοδο της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης με πολυμεράση (real-time quantitative PCR)

Abstract

The aim of the present PhD thesis was to estimate the detection ofhuman papillomavirus (HPV) in tumourigenesis of human urinary bladder,using the Real Time quantitative polymerase chain reaction (Real-TimeqPCR) and the effectiveness of this method, in order to be a future safeprotocol for the detection of HPV in patients with bladder cancer. Furthermorewe studied the detection of human herpesviruses and Polyoma viruses (BKand JC) in the same patients, using the method of polymerase chain reaction.For this PhD thesis we used 30 specimens of tumour tissue and 30specimens of adjacent healthy bladder tissue, which originated from patientswho underwent surgical transurethral resection at the Department of Urology,Asklipeiion General Hospital, Voula, Athens, Greece.We failed to detect positive samples for HPV infection, not only fromcancerous bladder specimens, but also from adjacent healthy bladder tissue,although we used three different methods for detection of genetic material ofthe virus, with progressively increasing sensitivity (PCR, nested-PCR, RTqPCR)We obtained different results trying to detect human herpesvirus andPolyoma virus genome, using the polymerase chain reaction (PCR)technique. For HSV-1, HSV-2, VZV and HHV-7 both tumour and normalspecimens, were negative for the detection of the presence of viral specificgenome.Cytomegalovirus DNA was detected in 22 tumour samples and 23normal samples. 17 paired samples were also detected for CMV DNA.EBV DNA was detected in 15 tumour samples and 4 normal samples.1 paired sample was also detected for EBV DNA.HHV-6 DNA was detected in 11 tumour samples and 1 normal sample.3 paired samples were also detected for HHV-6 DNA.KSHV DNA was detected in 1 tumour sample and 2 normal samples.None paired sample was detected for KSHV DNA.Polyoma BK and JC viral DNA was detected in 4 tumour samples.None normal sample was positive for the detection of Polyoma BK and JC viral DNA. None paired sample was detected for Polyoma BK and JC viralDNA.Meanwhile EBV DNA presence was abundant in tumour samplescompared to normal tissue with statistical significance (p=0,0048). A small yetnotable percentage of samples examined (10%) contained CMV and HHV-6(6,7%), CMV and EBV (3,3%) sequences raising the possibility of synergismbetween these viruses in urinary bladder carcinogenesis

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η εκτίμηση τηςμοριακής ανίχνευσης του ιού του ανθρώπινου θηλώματος (HPV) στηνκαρκινογένεση της ουροδόχου κύστεως του ανθρώπου, με τη βοήθεια τηςποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης με πολυμεράση σε πραγματικό χρόνο(Real-Time qPCR), καθώς και η μελέτη της συγκεκριμένης μεθόδου ως προςτην αποτελεσματικότητά της, ώστε να μπορέσει μελλοντικά να χρησιμοποιηθείως ασφαλές πρωτόκολλο ανίχνευσης του HPV στους καρκίνους τηςουροδόχου κύστεως. Επίσης μελετήθηκε η ανίχνευση των ερπητοϊών και τωνPolyoma (ΒΚ και JC) ιών του ανθρώπου στους ίδιους ασθενείς με τη μέθοδοτης αλυσιδωτής αντίδρασης με πολυμεράση. Για τη διατριβήχρησιμοποιήθηκαν δείγματα χειρουργικώς εξαιρεθέντων ιστοτεμαχίωνθηλωμάτων ουροδόχου κύστεως, από 30 ασθενείς, προερχόμενα από ιστό μεκαρκινική βλάβη (30 τεμάχια) και από παρακείμενο της βλάβης υγιή ιστό (30τεμάχια). Τα δείγματα αποστάληκαν από την Ουρολογική Κλινική του ΓενικούΝοσοκομείου «Ασκληπιείο Βούλας» Αττικής (Διευθυντής Καθ. Δ. Δελακάς).Κάθε δείγμα είχε εξεταστεί παθολογοανατομικά για την επιβεβαίωση τηςιστολογίας του.Από τα 30 δείγματα καρκινικού ιστού και τα 30 δείγματα παραπλήσιουφυσιολογικού ιστού που μελετήθηκαν για την ανίχνευση του HPV,χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές μεθόδους ανίχνευσης γενετικού υλικούτου ιού με προοδευτικά αυξανόμενη ευαισθησία (PCR, nested PCR και RealTime qPCR), δεν καταφέραμε να ανιχνεύσουμε την παρουσία DNA του ιούτου θηλώματος του ανθρώπου (HPV).Διαφορετικά ήταν τα αποτελέσματα από την προσπάθεια ανίχνευσηςγενετικού υλικού από τα προαναφερόμενα δείγματα, για τους ερπητοϊούς καιτους Polyoma ιούς του ανθρώπου. Συγκεκριμένα με τη χρήση ειδικώνεκκινητών και χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης μεπολυμεράση (PCR), είχαμε τα εξής αποτελέσματα: για τους ερπητοϊούς HSV-1, HSV-2, VZV και HHV-7, τόσο τα καρκινικά δείγματα, όσο και αυτά πουπροέρχονταν από τον παραπλήσιο φυσιολογικό ιστό, ήταν αρνητικά για τηνπαρουσία γενετικού υλικού αυτών των ιών. Σε 22 περιπτώσεις καρκινικών δειγμάτων και σε 23 περιπτώσειςδειγμάτων από παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς, είχαμε θετικάαποτελέσματα για CMV μόλυνση, ενώ σε 17 περιπτώσεις είχαμε ζεύγηδειγμάτων που προέρχονταν από τον ίδιο ασθενή, θετικά για CMV μόλυνση.Σε 15 περιπτώσεις καρκινικών δειγμάτων και σε 4 περιπτώσειςδειγμάτων από παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς, είχαμε θετικάαποτελέσματα για EBV μόλυνση, ενώ σε μία περίπτωση είχαμε ζεύγοςδείγματος που προερχόταν από τον ίδιο ασθενή, θετικό για EBV μόλυνση.Σε 11 περιπτώσεις καρκινικών δειγμάτων και σε 11 περιπτώσειςδειγμάτων από παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς, είχαμε θετικάαποτελέσματα για ΗΗV-6 μόλυνση, ενώ σε τρεις περιπτώσεις είχαμε ζεύγηδειγμάτων που προέρχονταν από τον ίδιο ασθενή, θετικά για ΗΗV-6 μόλυνση.Σε μία περίπτωση καρκινικού δείγματος και σε δύο περιπτώσειςδειγμάτων από παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς, είχαμε θετικάαποτελέσματα για KSHV μόλυνση, ενώ σε καμία περίπτωση δεν είχαμε θετικόζεύγος δείγματος που προερχόταν από τον ίδιο ασθενή, για KSHV μόλυνση.Τέλος, όσον αφορά τους Polyoma ιούς του ανθρώπου BKV και JCV, σετέσσερις περιπτώσεις καρκινικών δειγμάτων είχαμε θετικά αποτελέσματα γιαHPyV μόλυνση. Δεν είχαμε όμως κανένα θετικό δείγμα προερχόμενο απότους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς. Επίσης σε καμία περίπτωση δενείχαμε ζεύγη δειγμάτων που προέρχονταν από τον ίδιο ασθενή, θετικά γιαHPyV μόλυνση.Εν τω μεταξύ η παρουσία DNA του ΕΒV, ήταν άφθονη σε δείγματαόγκων συγκριτικά με το φυσιολογικό ιστό, αποτελώντας στατιστικά σημαντικόεύρημα (p=0,0048). Ένα μικρό αλλά αξιοσημείωτο ποσοστό των δειγμάτωνπου εξετάστηκαν (10%) περιείχε CMV και HHV-6 (6,7%), CMV και EBV(3,3%) αλληλουχίες, αυξάνοντας έτσι την πιθανότητα της συνεργίας μεταξύαυτών των ιών στην καρκινογένεση της ουροδόχου κύστης.