Μελέτη των μεταμεταγραφικών μηχανισμών γονιδιακής ρύθμισης στη φυσιολογία και τον μετασχηματισμό διαφοροποιημένων επιθηλίων σε διαγονιδιακά συστήματα επιλεκτικής τροποποίησης

Abstract

Cellular differentiation, proliferation and stress response are complex processes underlined by the differential expression of many genes. The control of such gene expression programs does not only involve transcriptional machines but extent to post-transcriptional events targeting protein synthesis via the regulation of mRNA transport, stability and translation. Post-transcriptiuonal aberrations can alter physiological gene expression patterns and provide the impetus for cellular transformation or tissue damage. The post-transcriptional regulation of mRNA utilization depends upon the interactions of RNA molecules with a number of RNAbinding proteins. HuR, is such a protein with an affinity for mRNA’s containing U and AU-rich elements that usually encode stress, angiogenic and growth factors, oncoproteins and cytokines. Prior molecular and biochemical evidence have indicated that HuR’s functions towards the prudent regulation of cellular proliferation, inflammatory response and death depends upon a multitude of intracellular and extracellular signalling modules. The main aim of the described research project was the identification of HuR’s functional role in embryonic development and especially in the development, physiology and transformation of epithelia. More specifically, we utilized transgenic systems of obligatory and conditional permutation, gene expression measurements and animal models of cellular transformation to identify HuR’s involvement in: Embryonic Development Development and function of trophoblastic epithelia in extraembryonic placenta Physiology and differentiation of intestinal epithelial cells Trasformation of intestinal epithelial cells. The role of HuR in embryonic development was initially studied via its obligatory deletion in the mouse. This mutation induced embryonic lethality during gastrulation. By restricting the mutation in the epiblast or maternal/fetal endothelia, we were able to demonstrate that lethality was due to a blockade in the development of extraembryonic placenta. More specifically, our study revealed that HuR was necessary for the proper development of a specific subset of trophoblastic epithelia – namely the syncitiotrophoblasts- which control the morphogenesis and vascularization of the placental labirynth, following chorioallantoic fusion. HuR-null embryos rescued from these placental defects proceeded to subsequent developmental stages but displayed defects in skeletal ossification, fusions in limb elements, and asplenia. Despite the apparent differences in the tissues that were affected by HuR’s absence, their developmental patterns share similarities since they rely on mesenchymal signals targeting epithelia for their differentiation which in turn support vascularization. The involvement of HuR in these cellular events was demonstrated further by microarray and bioinformatic profiling, HuR:RNP immunoprecipitations and measurements of mRNA transcription, stability and translation. Our experimental approach revealed that HuR controls the biosynthesis of morphogenic factors like FGF10 and the Tbx4, Ets2 and Hoxd13 transcription factors.

Η διαφοροποίηση, ο πολλαπλασιασμός και οι αντιδράσεις των κυττάρων ενός ιστού σε εξωγενή ερεθίσματα αποτελούν σύνθετες κυτταρικές διεργασίες και, ως εκ τούτου, καθορίζονται από τη διαφορική έκφραση πολλών γονιδίων. Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης τελείται τόσο στο επίπεδο της μεταγραφής του RNA όσο και σε μεταμεταγραφικά στάδια που καθορίζουν τη πρωτεϊνοσύνθεση μέσα από τη ρύθμιση της μεταφοράς, τη σταθερότητας και της μεταφραστικής ικανότητας του mRNA. Η αλλοίωση των μεταμεταγραφικών διεργασιών μπορεί να απορυθμίσει τα ισοζύγια φυσιολογικής έκφρασης και να προκαλέσει καρκινική εξαλλαγή ή ιστική βλάβη. Οι μεταμεταγραφικοί μηχανισμοί βασίζονται στις αλληλεπιδράσεις μορίων RNA με ριβονουκλεοπρωτεΐνες. Η ριβονουκλεοπρωτεΐνη HuR προσδένει μόρια mRNA που περιέχουν αλληλουχίες πλούσιες σε βάσεις Ουρακίλης ή/και Αδενίνης (AU-rich elements, AREs) και που περιλαμβάνουν τα mRNA ογκογονικών και αγγειογενετικών παραγόντων, μορίων του κυτταρικού στρες και κυτταροκινών. Πρόσφατα βιοχημικά και λειτουργικά στοιχεία υπέδειξαν ότι η δράση της ΗuR καθορίζεται από ενδογενή και εξωγενή σήματα προς τη φυσιολογική ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της αντίδρασης σε προφλεγμονώδη σήματα και του κυτταρικού θανάτου. Επιπρόσθετα η αλλοίωση της δράσης της HuR σε επιθηλιακά κύτταρα σχετίζεται με την ανάπτυξη μορφών καρκίνου και ανοσοπαθολογίας. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της δράσης της ριβονουκλεοπρωτεΐνης HuR στη εμβρυϊκή ανάπτυξη και την ειδικότερη φυσιολογία και τον μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα εφαρμόσαμε διαγονιδιακές μεθοδολογίες καθολικής και επιλεκτικής γονιδιακής απενεργοποίησης στον ποντικό, αναλύσεις γονιδιακής ρύθμισης και πειραματικά πρότυπα καρκινικής εξαλλαγής για να αποσαφηνίσουμε τον λειτουργικό ρόλο της HuR: Στο σύνολο της εμβρυϊκής ανάπτυξης Στην ανάπτυξη και τη φυσιολογία των τροφοβλαστικών επιθηλιακών κυττάρων του εξω-εμβρυϊκού πλακούντα Στη φυσιολογία και τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων του εντερικού βλεννογόνου. Στην καρκινική εξαλλαγή των επιθηλιακών κυττάρων του εντερικού βλεννογόνου. Ο ρόλος της πρωτεΐνης ΗuR στην εμβρυϊκή ανάπτυξη αναλύθηκε μέσα από την καθολική της απαλοιφή από τον οργανισμό του ποντικού. Η μεταλλαγή αυτή προκάλεσε τη θνησιμότητα του εμβρύου στο στάδιο της γαστριδίωσης. Η εφαρμογή επιλεκτικών γονιδιακών τροποποιήσεων αποκλειστικά σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ή σε μητρικά/εμβρυϊκά ενδοθήλια αποκάλυψε ότι η θνησιμότητα οφειλόταν σε παρεμπόδιση της ανάπτυξης των εξω-εμβρυϊκών δομών του πλακούντα. Ποιο συγκεκριμένα η μελέτη μας αποκάλυψε ότι η HuR είναι απαραίτητη για την διαφοροποίηση μιας συγκριμένης κατηγορίας επιθηλιακών κυττάρων -των συγκυτιοτροφοβλαστικών κυττάρων- που ελέγχουν την μορφογένεση και την αγγείωση του λαβυρίνθου του πλακούντα κατά την σύζευξη της αλλαντοϊδας με τις τροφοβλαστικές στοιβάδες του χορίου. Κατά συνέπεια, η απαλοιφή της HuR, κατέστειλε την ανάπτυξη και την αγγείωση του λαβύρινθού εμποδίζοντας έτσι την υποστήριξη της εμβρυϊκής ανάπτυξης.