Διερεύνηση του ρόλου μεταμεταγραφικών παραγόντων στην ανοσοβιολογία και την ανάπτυξη των ΙΦΝΕ με χρήση διαγονιδιακών συστημάτων επιλεκτικής αφαίρεσης

Abstract

Innate immunity has evolved to recognize and respond rapidly to infection and tissue damage whilst maintaining inflammatory homeostasis and support to adaptive immunity. These complex responses depend on mechanisms controlling the expression of differentiation factors, cytokines, antigen presentation molecules and a hitherto of inflammatory mediators. Prior research has demonstrated that the biosynthesis of innate effector molecules is regulated at the post-transcriptional level which determines the utilization of the corresponding mRNAs. These post- transcriptional processes comprise a series of overlapping mechanisms controlling the subcellular localization, decay and translation of mRNA molecules via dynamic interactions with RNA binding proteins (RBPs). As has been demonstrated in animal models of acute and chronic inflammation (e.g. rheumatoid arthritis and Crohn’s disease), defects in post-transcriptional regulation may provide the impetus for the development of disease. The research presented focuses on the analysis of the functional role of RNA- binding proteins (RBPs) that interact with mRNA’s containing AU-rich elements. Such mRNAs are critical for innate immunity since the usually encode stress factors and inflammatory mediators. Specifically, we focus on the functions of the RBPs Elavll/HuR and hnRNPD/AUF1 during the development, induction and activity of innate immune cells. Our experimental approach involved the application of: novel transgenic systems of RBP deletion in hematopoietic cells, animal models of acute inflammation and Inflammatory Bowel Disease (IBD), and gene expression measurements.The comparison between HuR’s deletion in hematopoietic stem versus myelopoietic progenitor cells revealed HuR’s functions towards the regulation of hematopoietic differentiation of: (a) stem to progenitor cells and (b) myelopoietic progenitors to mature myeloid lineages, including innate effectors. The functions of HuR in these differentiation processes correlate with its functions in controlling cell cycle regulators and differentiation signals. Still, and in the case of myelopoietic deletions of HuR, the differentiation defect could be restored in the presence of high levels of differentiation factors or in the presence of inflammation. This, allowed us to dissect further the role of HuR in innate immune responses. From our data, it is clear that HuR controls the equilibrium in the production of pro- and anti- inflammatory mediators by organizing the RBP associations which control mRNA decay and translation. This property of HuR, render the outcome of its functions as immunomodulating and anti-inflammatory and was further revealed in animal models of endotoxemia and IBD. To validate the anti-inflammatory effects of HuR we also employed a drug-inducible HuR overexpression system that attenuated the development of acute IBD. This latest finding indicates the therapeutic potential of pharmaceutical modulation of HuR’s functions. Contrary to HuR, the myeloid restricted deletion of AUF1 revealed that it does not play a role in the development of innate cells but it does act as a pro- inflammatory RBP. Still its functions do not appear to relate to cytokine production, which against previous data and against AUF1’s role as an antagonist for HuR’s functions. Collectively our data demonstrate that HuR and AUF1 are involved in different responses and highlight HuR’s role as putative organizer of post- transcriptional networks.

Τα κύτταρα της έμφυτης ανοσίας έχουν εξελιχθεί τόσο για να αναγνωρίζουν και να αντιδρούν άμεσα στη λοίμωξης και της ιστικής βλάβης όσο και για να ρυθμίζουν τη φλεγμονώδη ομοιόσταση και να υποστηρίζουν της αντιδράσεις της επίκτητης ανοσίας. Οι πολύπλοκες αυτές αντιδράσεις βασίζονται σε μηχανισμούς ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης παραγόντων διαφοροποίησης, κυτταροκινών, αντιγονοπαρουσιαστικών μορίων και άλλων παραγόντων της φλεγμονής. Είναι πλέον σαφές ότι η βιοσύνθεση μορίων που εμπλέκονται στις δράσεις της έμφυτης ανοσίας, ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό από μεταμεταγραφικούς μηχανισμούς που καθορίζουν τη «χρήση» των αντίστοιχόν mRNA. Οι μεταμεταγραφικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν σειρά διαδικασιών οι οποίες καθορίζουν τα επιμέρους στάδια του μεταβολισμού του mRNA (σταθερότητα, υποκυτταρικός εντοπισμός, μετάφραση) και ελέγχονται από τις δυναμικές αλληλεπιδράσεις μορίων RNA με ειδικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες (RBP) που τα αναγνωρίζουν. Όπως έχει αποδειχθεί σε περιπτώσεις οξείας και χρόνιας φλεγμονής (π.χ. ρευματοειδής αρθρίτιδα, νόσος Crohn), η απορρύθμιση των παραπάνω διεργασιών μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογικές κυτταρικές αντιδράσεις, οι οποίες με τη σειρά τους θα αποτελέσουν τη βάση για την ανάπτυξη παθολογίας. Αντικείμενο της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η ανάλυση του βιολογικού ρόλου ριβονουκλεοπρωτεϊνών που εμπλέκονται στη μεταμεταγραφική ρύθμιση των mRNA που περιέχουν αλληλουχίες αδενίνης και ουρακίλης (ARE) και που κωδικοποιούν παράγοντες του στρες και της φλεγμονής. Πιο συγκεκριμένα η εργασία επικεντρώθηκε στις δράσεις, πρωτίστως της RBP Elavll/HuR και δευτερευόντως της RBP hnRNPD/AUF1, στον καθορισμό της έμφυτης ανοσίας με εφαρμογή: καινοτόμων μεθοδολογιών διαγονιδιακής απαλοιφής των RBP από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα in vivo, πειραματικών προτύπων οξείας φλεγμονής και φλεγμονωδών νοσημάτων του εντέρου και μελετών γονιδιακής έκφρασης. Η απώλεια της HuR σε διαφορετικά αιμοποιητικά στάδια αποκάλυψε τον λειτουργικό της ρόλο στην ρύθμιση της αιμοποιητικής διαφοροποίησης: (α) των αρχεγόνων κυττάρων προς τα προγονικά και (β) των προγονικών μυελοποιητικών κυττάρων προς τα ώριμα μυελοειδή συμπεριλαμβανομένων και των κυττάρων μονοκυττάρων/μακροφάγων και των πολυμορφοπύρηνων. Ο αιμοποιητικός ρόλος της HuR συσχετίστηκε με τη ρύθμιση μορίων που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο των αρχέγονων και προγονικών κυττάρων καθώς και με τις δράσεις παραγόντων διαφοροποίησης. Παρά ταύτα και στην περίπτωση της μυελοειδικής απαλοιφής της HuR, ο φαινότυπος αυτός είναι αντιστρέψιμος είτε με την αυξημένη παρουσία παραγόντων διαφοροποίησης ή την παρουσία φλεγμονής γεγονός που επέτρεψε τη διαλεύκανση του ρόλου της HuR στις φλεγμονώδεις αντιδράσεις της έμφυτης ανοσίας. Από τα αποτελέσματα μας προκύπτει ότι η HuR παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του ισοζυγίου προ- και αντι-φλεγμονωδών κυτταροκινών μέσα από την αλληλεπίδραση με τα mRNA που τις κωδικοποιούν και την διαφορική της δράση προς την οργάνωση των ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων που καθορίζουν την σταθερότητα και την μεταφρασιμότητά τους. Η διατήρηση αυτού του ισοζυγίου προσδίδει στη HuR μια ανοσορρυθμιστική και αντιφλεγμονώδη δράση η οποία πιστοποιήθηκε τόσο στην ανάπτυξη πειραματικών προτύπων σηπτικής καταπληξίας όσο και σε πειραματικά πρότυπα Ιδιοπαθών Φλεγμονωδών Νοσημάτων του Εντέρου (ΙΦΝΕ). Για την πιστοποίηση της αντιφλεγμονώδους δράσης της HuR στην ανάπτυξη των ΙΦΝΕ, επιχειρήσαμε μια φαρμακο-διαγονιδιακή διαδικασία υπερ-έκφρασης της, η οποία κατέστειλε την ανάπτυξη της νόσου αναδεικνύοντας το θεραπευτικό δυναμικό φαρμακευτικών ρυθμίσεων των δράσεων της HuR. Αντίθετα τα αποτελέσματα μας για τις δράσεις της AUF1, όπως προκύπτουν από τη μυελοειδική απαλοιφή της έδειξαν ότι δεν σχετίζεται με τη ρύθμιση της αιμοποίησης αλλά δρα ως προφλεγμονώδης παράγοντας, χωρίς όμως να επηρεάζει τη βιοσύνθεση βασικών κυτταροκινών. Τα αποτελέσματά μας έρχονται σε αντίθεση με ένα πλήθος βιβλιογραφικών αναφορών που υποδεικνύουν ότι η HuR και ο AUF1 έχουν ανταγωνιστικές δράσεις στα ίδια mRNA και αναδεικνύουν τη HuR ως πιθανό κυρίαρχο διοργανωτή μεταμεταγραφικών δικτύων.