TRANSIENT INACTIVATION OF ALMOND MANDELONITRILE LYASE BY 3 - METHYLENEOXINDOLE:A PHOTOOXIDATION PRODUCT OF THE NATURAL PLANT HORMONE INDOLE - 3 - ACETIC ACID

Abstract

THIS THESIS HAS FOCUSED ON MANDELONITRILE LYASE (EC 4.1.2.10) WHICH CATALYZES THE DECOMPOSITION OF (R) - MANDELONITRILE TO HYDROGEN CYANIDE AND BENZALDEHYDE.THE MAJOR NATURAL AUXIN, INDOLE - 3 - ACETIC ACID, WAS FOUND TO INACTIVATE THE ENZYME IN A REACTION FOLLOWING PSEUDO - FIRST - ORDER KINETICS AND DEPENDENT UPON VISIBLE LIGHT. INACTIVATION RESULTS FROM THE OXIDATIVE DECARBOXYLATION OF INDOLE - 3 - ACETIC ACID FORMING 3 - METHYLENEOXINDOLE. THIS COMPOUND HAS BEEN SYNTHESIZED AND SHOWN TO PRODUCE TIME - DEPENDENT LOSS OF ENZYME ACTIVITY IN A REACTION THAT IS ACTIVE - SITE - DIRECTED. APPROXIMATELY 30% ACTIVITY WAS RECOVERED FOLLOWING DIALYSIS AND A NEARLY QUANTITATIVE RECOVERY OCCURS IN THE PRESENCE OF A VARIETY OF THIOLS, INDICATING THAT THE ADDUCT IS CABILE. THEENZYME INACTIVATION PROCEEDS WITH THE LOSS OF 1 - 2 THIOL RESIDUES, WHILE THE EFFECT OF PH ON THE INACTIVATION REACTION SUGGESTS MODIFICATION OF A SINGLEAMINO ACID FUNCTIONAL GROUP WITH AN APPARENT PKA OF 5.60+-0.03. RADIOLABELING OF THE ENZYME WITH TRITIATED 3 - METHYLENEOXINDOLE GAVE A 1:1 STOICHIOMETRY OF INHIBITOR PER ENZYME ACTIVE SITE. ALL OUR EXPERIMENTAL DATA ARE CONSISTENT WITH MODIFICATION OF AN ACTIVE - SITE CYSTEINE RESIDUE OF MANDELONITRILE LYASE.

Η ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΥΤΗ ΕΞΕΤΑΖΕΙ ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΛΥΑΣΗ ΤΟΥ (R) - ΜΑΝΤΕΛΟΝΙΤΡΙΛΙΟΥ (EC 4.1.2.10) ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΚΑΤΑΛΥΕΙ ΤΗ ΔΙΑΣΠΑΣΗ ΤΟΥ (R) - ΜΑΝΤΕΛΟΝΙΤΡΙΛΙΟΥ ΣΕ ΥΔΡΟΚΥΑΝΙΟ ΚΑΙ ΒΕΝΖΑΛΔΕΥΔΗ. Η ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΗ ΦΥΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ, ΤΟ ΙΝΔΟΛΟΞΙΚΟ ΟΞΥ, ΟΔΗΓΗΣΕ ΣΕ ΠΛΗΡΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΣΕ ΜΙΑ ΠΡΩΤΗΣ ΤΑΞΕΩΣ ΚΙΝΗΤΙΚΑ ΚΑΙ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΗΣ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΦΩΤΟΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ. Η ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΠΟΔΟΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΙΩΣΗ ΤΟΥ ΙΝΔΟΛΟΞΙΚΟΥ ΟΞΕΩΣ ΠΟΥ ΟΔΗΓΕΙ ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΟΥ3 - ΜΕΘΥΛΕΝΟ - ΟΞΥΙΝΔΟΛΙΟΥ. ΤΟ 3 - ΜΕΘΥΛΕΝΟ - ΟΞΥΙΝΔΟΛΙΟ ΣΥΝΤΕΘΗΚΕ ΚΑΙ ΑΠΟΔΕΙΧΤΗΚΕ ΟΤΙ ΑΥΤΗ ΕΙΝΑΙ Η ΕΝΩΣΗ Η ΟΠΟΙΑ ΕΙΝΑΙ ΥΠΕΥΘΥΝΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΛΥΑΣΗΣ ΚΑΙ ΟΤΙ Η ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΕΤΑΙ ΣΤΟ ΕΝΕΡΓΟ ΚΕΝΤΡΟ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ. ΠΕΡΙΠΟΥ 30% ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΕΠΑΝΑΚΤΗΘΗΚΕ ΜΕ ΑΡΑΙΩΣΗ, ΕΝΩ ΕΙΧΑΜΕ ΣΧΕΔΟΝ ΟΛΟΚΛΗΡΩΤΙΚΗ ΑΝΑΚΑΜΨΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΜΕΡΚΑΠΤΑΝΩΝ. Η ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΛΥΑΣΗΣ ΣΥΝΟΔΕΥΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΠΩΛΕΙΑ 1 - 2 ΚΥΣΤΕΙΝΩΝ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ, ΕΝΩ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ PH ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΥΠΟΔΗΛΩΝΕΙ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΕΝΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΣ ΜΕ PKA = 5,60+-0.03. ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΕ 3 - ΜΕΘΥΛΕΝΟ - ΟΞΥΙΝΔΟΛΙΟ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΟ ΜΕ ΤΡΙΤΙΟ ΕΔΕΙΞΑΝ ΟΤΙ Η ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ ΤΗΣ ΛΥΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ ΕΙΝΑΙ 1:1. ΟΛΑ ΤΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΔΗΓΟΥΝ ΣΤΟ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ ΟΤΙ ΠΡΟΚΕΙΤΑΙ ΓΙΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΜΙΑΣ ΚΥΣΤΕΙΝΗΣ Η ΟΠΟΙΑ ΒΡΙΣΚΕΤΑΙ ΣΤΟ ΕΝΕΡΓΟ ΚΕΝΤΡΟ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ.