Μελέτη του ρόλου των ρυθμιζόμενων μέσω WNT lnc-RNA στην ομοιόσταση και στον καρκίνο του εντέρου

Abstract

The canonical WNT pathway plays a central role in intestinal self-renewal, affecting the transcription profile of multiple genes involved in development, proliferation and stem cell maintenance. The aberrant activation of the pathway is among the primary factors leading to the onset of Colorectal Cancer (CRC). Due to their complexity, the full repertoire of mechanisms involved in WNT-dependent regulation of target genes, remains elusive. Nonetheless, solid evidence indicates that a plethora of targets and regulatory elements of the effector β-catenin/TCF4 transcriptional complex reside in non-coding regions, pointing to the existence of long non-coding RNAs that mediate WNT-dependent transcriptional responses. In our study, we are focusing on the characterization of the nuclear lnc-RNA WiNTRLINC1. This transcript is a direct target of the β-catenin/TCF4 complex and its expression is significantly increased in intestinal cancers, implying an oncogenic function. WiNTRLINC1 is a critical positive regulator of its neighboring gene ASCL2, a transcription factor that is required for the maintenance of intestinal stem cells. WiNTRLINC1 interacts directly with the β-catenin/TCF4 transcriptional complex and they together participate in the formation of a chromatin loop. This loop bridges the promoter of WiNTRLINC1 with the enhancer regulatory region that is located downstream of ASCL2 gene, activating the expression of the latter. Then, ASCL2 activates transcriptionally the expression of WiNTRLINC1, closing a feed forward regulatory loop that is responsible for the regulation of many stem cell-related genes. The WiNTRLINC1/ASCL2 regulatory axis is highly amplified in patients suffering from CRC and correlates with increased metastatic potential and decreased patient survival. Therefore, our results strongly point to the association between WiNTRLINC1 and WNT signaling output, highlighting the former’s diagnostic and therapeutic potential. It is noteworthy that our research about WNT-regulated lnc-RNAs highlighted another lnc-RNA, lnc-IGSF9, as a negative target of the canonical WNT pathway, whose expression is decreased in CRC patients. Overexpression of lnc-IGSF9 in CRC cell lines increases the expression of genes that control cell adhesion, ultimately promoting cell differentiation. Amongst the up-regulated genes, we distinguished its neighbor IGSF9, as a putative mediator of lnc-IGSF9 function. IGSF9 is a cell adhesion protein, whose reduced expression strongly correlates with CRC manifestation. Further functional experiments demonstrate that lnc-IGSF9 and IGSF9 follow a similar expression pattern in both healthy and cancerous tissues, with lnc-IGSF9 directly affecting IGSF9 expression but not vice versa. In parallel, we investigated the role of the intestinal-specific CDX2 transcription factor, a protein that was identified as an interactor of lnc-IGSF9 in RNA pull-down experiments. Re-analysis of publicly available ChIP-seq data in LS174T cells revealed that CDX2 binds strongly to both the promoter and a putative intronic enhancer region of lnc-IGSF9, pointing its putative regulatory role in the expression of both genes. Follow-up experiments clearly show that in-trans overexpression of CDX2, leads to the upregulation of both lnc-IGSF9 and IGSF9, pointing to a regulatory mechanism between the three components which may be subverted during carcinogenesis. In conclusion, further investigations should be conducted in order to delineate the exact mechanism of function of lnc-IGSF9 in mediating the CDX2-driven upregulation of IGSF9.

Το κανονικό μονοπάτι της σηματοδότησης WNT διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση του εντερικού επιθηλίου, επηρεάζοντας γονιδιακές αποκρίσεις που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διατήρηση των βλαστοκυττάρων. Ωστόσο, παρά τον κρίσιμο ρόλο του στη διατήρηση της ομοιόστασης των οργανισμών και παρότι η ανώμαλη ενεργοποίηση του αποτελεί πρωταρχικό παράγοντα για την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην από WNT μεσολαβούμενη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Πλέον γνωρίζουμε ότι μια πληθώρα από τα γονίδια και τις ρυθμιστικές περιοχές που προσδένονται από το σύμπλοκο β-κατενίνης/TCF4 εδράζονται σε μη κωδικές περιοχές του γονιδιώματος, όπως πχ σε γονίδια που μεταγράφουν μακρά μη-κωδικά RNA (long non-coding RNAs, lnc-RNAs) τα οποία συμμετέχουν σε από WNT μεσολαβούμενες μεταγραφικές αποκρίσεις. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάστηκε στο χαρακτηρισμό του πυρηνικού lnc-RNA WiNTRLINC1. Το γονίδιο του WiNTRLINC1 αποτελεί άμεσο στόχο των β-κατενίνη/ΤCF4 και η έκφραση του αυξάνεται σημαντικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου, υποδηλώνοντας ότι δρα ως ογκογονίδιο. Το WiNTRLINC1 μεσολαβεί στη ρύθμιση της έκφρασης του γειτονικού του γονιδίου ASCL2, το οποίο κωδικοποιεί έναν μεταγραφικό παράγοντα απαραίτητο για τη διατήρηση των βλαστοκυττάρων του εντέρου. Πιο συγκεκριμένα, το WiNTRLINC1 αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο β-κατενίνης/TCF4 έτσι ώστε όλα μαζί να συμμετάσχουν στο σχηματισμό ενός χρωματινικού βρόχου. Αυτός ο βρόχος φέρνει κοντά τον υποκινητή του WiNTRLINC1 με τον ενισχυτή που εδράζεται στο 3’ άκρο του ASCL2, αυξάνοντας την έκφραση του τελευταίου. Η πρωτεΐνη ASCL2 ενεργοποιεί μεταγραφικά με τη σειρά της την έκφραση του WiNTRLINC1, κλείνοντας ένα θετικό ρυθμιστικό κύκλωμα. Ο ρυθμιστικός άξονας των WiNTRLINC1/ASCL2 είναι υπέρ-ενεργός σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και σχετίζεται με μειωμένη επιβίωση των ασθενών. Κατά συνέπεια, αποκαλύπτεται η πιθανή προγνωστική και θεραπευτική αξία του συγκεκριμένου lnc-RNA στην αντιμετώπιση του καρκίνου του εντέρου. Η έρευνα μας σχετικά με τα lnc-RNA που ρυθμίζονται από τον καταρράκτη σηματοδότησης WNT αποκάλυψε ένα άλλο lnc-RNA, το lnc-IGSF9, ως ένα αρνητικό στόχο του μονοπατιού WNT, η έκφραση του οποίου μειώνεται σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Η αύξηση των επιπέδων έκφρασης του lnc-IGSF9 σε εντερικές καρκινικές σειρές ενεργοποιεί την έκφραση πολλών γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση, προάγοντας τελικά την διαφοροποίηση των κυττάρων. Από τα γονίδια των οποίων η έκφραση αυξήθηκε ξεχωρίσαμε αυτό του IGSF9, που είναι εντοπισμένο σε κοντινή απόσταση από το lnc-IGSF9, ως ένα πιθανό μεσολαβητή της λειτουργίας του παραπάνω lnc-RNA. Η πρωτεΐνη IGSF9 ανήκει στα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης και η μειωμένη έκφρασή της συσχετίζεται στενά με την ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου. Περαιτέρω λειτουργικά πειράματα απέδειξαν ότι τα γονίδια των lnc-IGSF9 και IGSF9 ακολουθούν ένα παρόμοιο πρότυπο έκφρασης τόσο σε υγιείς όσο και σε καρκινικούς ιστούς. Μάλιστα, το lnc-IGSF9 βρέθηκε ότι είναι απαραίτητο για την έκφραση της πρωτεΐνης IGSF9, όχι όμως και το αντίστροφο. Επιπλέον, ο εντερο-ειδικός μεταγραφικός παράγοντας CDX2 βρέθηκε να ρυθμίζει την έκφραση των δύο παραπάνω μορίων μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασής του με το lnc-IGSF9. Συμπερασματικά, χρειάζονται περαιτέρω πειράματα για να αποσαφηνίσουμε τον ακριβή μηχανισμό δράσης του lnc-IGSF9 και να βρούμε πως οι πρωτεΐνες CDX2 και IGSF9 εμπλέκονται σε αυτόν ώστε να καταστείλουν την καρκινογένεση στο έντερο.