Ανάπτυξη και εφαρμογή μοριακών μεθόδων στη γενετική ταυτοποίηση ειδών και τροφίμων ζωικής παραγωγής

Abstract

In the present PhD dissertation, methods for the identification of animal species and their products, were developed and validated. It is by far the most extensive genetic study of food authenticity in the Greek market, selecting two of the main food categories, meat products and fish, following EU guidelines after the food scandal of 2013. Thus, species-specific approaches using conventional and real-time PCR were used for the identification of meat species and applied to 100 commercial products. The estimated fraud rate was 11%. In many cases undeclared species were detected in small quantities (<1%) and were not included in fraud cases (Regulation EU 2014/180). The detection of these undeclared species is possibly due to insufficient equipment cleaning during the production. Horse DNA was not detected in any product, not even in very small quantities, which indicates market compliance after the 2013 food scandal. For the first time in the Greek market, an assessment of the quantitative statement of the label is made. It was found that the declared composition percentages of a species were in agreement with the results of the present work in a few samples. Finally, it was observed that some companies are more compliant, compared to others. In order to check accurate labeling in fish, the second main food category, a DNA barcoding method was used. This technique was applied to 332 commercial fish products from Greece (285) and Bulgaria (47). The percentage of mislabeling recorded in the Greek market during the period 2015-2018 was 12.9%. The continuous official controls seem to have had an effect, since in 2018 the lowest replacement rate was observed (4.7%). Most common cases of replacement were the replacement of Limanda aspera by Lepidopsetta polyxystra and substitutions among species of the genus Merluccius. Some cases of species replacement seem to be financially motivated, while others are due to common morphological characteristics or due to mixed fishing. The mislabeling rate in Bulgarian market was 4.7%. Except for food authenticity purposes, species identification is also important for ecosystems’ protection and management. For this reason, the developed DNA barcoding method was also used to identify invasive fish species, in two cases, which is significant for taking appropriate management actions. The first case concerned the identification of an individual, belonging to the Pterois miles species and this record, is the northernmost extension of the species in the Mediterranean Sea. The second case concerns the identification of individuals from two different areas in the state of Connecticut, detecting the presence of the invasive species Cottus immaculatus. The present dissertation contributes to the strengthening of the field of recognized professional rights of biologists in the field of food analysis. Legislation combined with the growing demand for transparency in the food sector make genetic analyses necessary. These methods, as it turned out, can be used to identify species with important applications.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν μέθοδοι για την ταυτοποίηση ζωικών ειδών και των προϊόντων τους. Αποτελεί την πιο εκτεταμένη γενετική ανάλυση της αυθεντικότητας των τροφίμων στην Ελληνική αγορά, επιλέγοντας δύο από τις κυριότερες κατηγορίες τροφίμων, τα προϊόντα κρέατος και τα ιχθυηρά και ακολουθώντας και τις κατευθυντήριες γραμμές της ΕΕ μετά το διατροφικό σκάνδαλο του 2013. Έτσι, για την ταυτοποίηση ειδών κρέατος χρησιμοποιήθηκαν ειδο-ειδικές προσεγγίσεις απλής και real-time PCR, οι οποίες εφαρμόστηκαν σε 100 εμπορικά προϊόντα. Το ποσοστό νοθείας που υπολογίστηκε ήταν 11%. Επιπλέον, σε πολλές περιπτώσεις ανιχνεύτηκαν αδήλωτα είδη σε μικρές ποσότητες (<1%) και δεν συμπεριλήφθηκαν στις περιπτώσεις νοθείας (Σύσταση ΕΕ 2014/180). Η ανίχνευση αυτών των μη δηλωμένων ειδών οφείλεται πιθανόν στον μη επαρκή καθαρισμό του εξοπλισμού κατά την παραγωγή των προϊόντων. DNA αλόγου δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα προϊόν, ούτε σε πολύ μικρές ποσότητες, υποδεικνύοντας συμμόρφωση της αγοράς μετά το διατροφικό σκάνδαλο του 2013. Για πρώτη φορά γίνεται εκτεταμένος έλεγχος της ορθότητας στην ποσοτική δήλωση της ετικέτας με DNA αναλύσεις. Βρέθηκε ότι τα αναγραφόμενα ποσοστά σύστασης ενός είδους συμφωνούσαν με τα αποτελέσματα της παρούσης εργασίας σε μικρό αριθμό δειγμάτων. Τέλος, παρατηρήθηκε ότι κάποιες εταιρείες είναι περισσότερο συμμορφούμενες, σε σχέση με κάποιες άλλες. Για τον έλεγχο της ακριβούς επισήμανσης στη δεύτερη βασική κατηγορία τροφίμων που επιλέχτηκε, τα ιχθυηρά χρησιμοποιήθηκε η τεχνική DNA barcoding. Η τεχνική αυτή εφαρμόστηκε σε 332 εμπορικά προϊόντα ιχθυηρών από την Ελλάδα (285) και τη Βουλγαρία (47). Το ποσοστό παραπλανητικής επισήμανσης που καταγράφηκε στην ελληνική αγορά τα έτη 2015-2018, ήταν 12,9%. Οι συνεχόμενοι έλεγχοι φαίνεται να είχαν αποτέλεσμα, καθώς το 2018 παρατηρήθηκε το μικρότερο ποσοστό αντικατάστασης (4,7%). Οι πιο κοινές περιπτώσεις παραπλανητικής επισήμανσης είναι αυτή της αντικατάστασης του είδους Limanda aspera από το είδος Lepidopsetta polyxystra και οι υποκαταστάσεις μεταξύ των ειδών του γένους Merluccius. Κάποιες περιπτώσεις αντικατάστασης ειδών φαίνεται να έχουν οικονομικό κίνητρο, ενώ κάποιες άλλες οφείλονται σε κοινά μορφολογικά χαρακτηριστικά, ή σε περιπτώσεις μικτής αλιείας. Το ποσοστό παραπλανητικής επισήμανσης στην αγορά της Βουλγαρίας ήταν της τάξης του 4,7%. Η ταυτοποίηση ειδών εκτός από την αυθεντικότητα των τροφίμων είναι σημαντική και για την προστασία και τη διαχείριση των οικοσυστημάτων. Για αυτό το λόγο η μέθοδος DNA barcoding που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε και για την ταυτοποίηση εισβολικών ειδών ιχθυηρών, σε δύο περιπτώσεις, το οποίο ήταν σημαντικό για τη λήψη αποφάσεων όσον αφορά τη διαχείριση αυτών των ειδών στην εκάστοτε περιοχή. Η πρώτη περίπτωση αφορούσε την ταυτοποίηση ενός ατόμου που ανήκει στο είδος P. miles και η συγκεκριμένη καταγραφή του είδους, αποτελεί τη βορειότερη επέκταση του είδους στη Μεσόγειο. Η δεύτερη περίπτωση αφορούσε την ταυτοποίηση ατόμων από δύο διαφορετικές περιοχές στην πολιτεία του Κοννέκτικατ, ανιχνεύοντας την παρουσία του εισβολικού είδους C. immaculatus. Η παρούσα διατριβή συντελεί στην ενδυνάμωση του πεδίου των αναγνωρισμένων επαγγελματικών δικαιωμάτων των βιολόγων όσον αφορά τις αναλύσεις τροφίμων. Η νομοθεσία σε συνδυασμό με την ολοένα και αυξανόμενη απαίτηση για διαφάνεια στον τομέα των τροφίμων φαίνεται να καθιστούν τις γενετικές αναλύσεις αναγκαίες. Οι συγκεκριμένες μέθοδοι, όπως αποδείχτηκε, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση ειδών με σημαντικές εφαρμογές.