Μελέτη της δράσης της αντι-ανδρογονικής θεραπείας στο μεταβολισμό, την αυτοφαγία και την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του προστάτη στην ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία

Abstract

The objective of the present study is to provide data about the in vitro efficacy of three anti-androgens (ARN-509/Apalutamide, Bicalutamide and Enzalutamide) to block the Androgen Receptor (AR) pathway and the induction of downstream genes, as well as their effect on PC cells proliferation. We also aim to study and compare the radio-sensitizing effect of three anti-androgens and the molecular pathways induced by this interaction. Two androgen- independent cell lines DU145, PC3 and the androgen- dependent 22Rv1 cell line were used for this study. At first, we tested the effect of testosterone, under the presence or absence of anti-androgens, on the proliferation of the three prostate cancer cell lines. Next, we identified changes induced by testosterone (with or w/o anti-androgens) on the cytoplasmic/nuclear kinetics of the AR and on the expression of AR down-stream proteins (PSA, TMPRSS2). We also studied the effects of testosterone and anti-androgens on the expression of proteins involved in tumour hypoxia, in anerobic metabolism and in autophagy. For the second stage, we investigate the radiation sensitivity of the three prostate cancer cells under exposure to Apalutamide, or Bicalutamide or Enzalutamide, in comparison to radiation alone. Furthermore, we investigated the death pathway induced by androgens in combination with RT. Finally, we used two NOD SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J, Genotype: HOM Homozygous for Prkdcscid) and R2G2 (B6.129-Rag2 tm1Fwa II2rg tm1Rsky /DwlHsd) and the 22Rv1 cell line, in order to study the radio-sensitizing effect of Apalutamide and Bicalutamide, in vivo. The hormone-responsive PC cell line, 22Rv1, showed an increase in proliferation and a strong response of AR and AR-V7 kinetics to testosterone. PSA and TMPRSS2 were also induced by testosterone in the 22Rv1 cells but not in the DU145 and PC3 cells. In addition, apalutamide had the most potent inhibitory effect on the testosterone-induced expression of AR and downstream genes in the 22Rv1 cells. Testosterone and anti-androgens did not change the expression levels of proteins related to hypoxia. Similarly, no changes were observed in the glucose metabolism pathway nor in the autophagy pathway. All three anti-androgens suppressed the proliferation/viability of all three PC cell lines at similar concentrations (10-50μM). Interestingly, Apalutamide and Enzalutamide at higher doses (100μΜ) resulted in the complete inhibition of proliferation in 22Rv1 hormone-sensitive cells and in a significant proliferation reduction in the PC3 and DU145 cells. The results of the radiation experiments showed that Enzalutamide and Apalutamide have a strong dose-dependent radiosensitivity effect in all three PC cell lines. An interesting finding was observed in all three cell lines when RT was combined with Apalutamide or Enzalutamide, albeit at a far lesser degree. At 30 minutes and 4h post RT confocal microscopy showed intense γΗ2ΑΧ foci localization in large round structures that indicated a specific death pattern that includes nuclear fragmentation. This type of cell death it is not apoptosis and does not occur when cells were treated with RT alone or RT combined with Bicalutamide.The in vivo experiments showed that both Apalutamide and Bicalutamide exhibited a significant radio-sensitizing effect, reducing the growth rate of xenografts compared to xenografts treated with radiation only. Apalutamide showed a significant stronger effect compared to Bicalutamide. Also, tumors treated with the combination of radiation and Apalutamide showed a significantly higher percentage of necrosis compared with tumors treated with radiation only or with radiation in combination with Bicalutamide. Finally, the chemo-sensitizing experiments showed that all three anti-androgens enhanced the cytotoxic effect of cabazitaxel in 22Rv1 cells, while only Apalutamide and Enzalutamide had the same effect in PC3 cells. On the other hand, none of anti-androgens showed any effect with cabazitaxel in DU145 cells. Apalutamide was the only anti-androgen that enhanced the cytotoxic effect of docetaxel and only in 22Rv1 cells. Overall, we showed that second generation anti-androgens (and especially Apalutamide) have a more potent effect on blocking the AR pathway and the testosterone- induced expression of downstream proteins such as PSA and TMPRSS2 than bicalutamide. Second-generation anti-androgens were also superior in suppressing prostate cancer cell proliferation. Moreover, we proved that second generation antiandrogens demonstrate a strong radio- sensitizing effect against prostate cancer cells regardless of hormone-dependency. That radio- sensitizing effect of Apalutamide is far stronger than the effect produced by bicalutamide. In vivo experiments confirmed the above findings. Our results can serve as a solid basis for subsequent clinical trials on the concurrent use of second generation anti-androgens (Apalutamide or Enzalutamide) in conjunction with Radiotherapy.

Στόχος μας είναι η συγκριτική μελέτη της αντι-νεοπλασματικής δράσης των 2 νεώτερων αντιανδρογόνων δεύτερης γενιάς (Απαλουταμίδη και Ενζαλουταμίδη), τα οποία πρόσφατα έγιναν διαθέσιμα στην κλινική πράξη, έναντι του κλασικού αντιανδρογόνου ‘Βικαλουταμίδη’, το οποίο χρησιμοποιείται εδώ και αρκετά χρόνια στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 2 ορμονο- ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη (PC3, DU145) και μία ευαίσθητη στις ορμόνες κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη (22Rv1). Αρχικά, μελετήσαμε την επίδραση της τεστοστερόνης, παρουσία ή απουσία αντιανδρογόνων, στον πολλαπλασιασμό των τριών κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τις αλλαγές που προκαλούνται από την τεστοστερόνη (με ή χωρίς την παρουσία αντιανδρογόνων) στην κυτταροπλασματική/ πυρηνική κινητική του AR και AR-V7, καθώς και στην έκφραση των πρωτεϊνών καθοδικών του μονοπατιού (PSA, TMPRSS2). Ακόμη, μελετήσαμε την επίδραση της τεστοστερόνης και των αντιανδρογόνων σε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην υποξία, στον ανερόβιο μεταβολισμό και στην αυτοφαγία. Στη συνέχεια, εξετάσαμε αν τα αντιανδρογόνα μπορούν να ευαισθητοποιήσουν τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη στην ακτινοβολία. Ακόμη, μελετήσαμε και το μονοπάτι κυτταρικού θανάτου που επάγεται από τον συνδυασμό τις ακτινοβολίας και των αντιανδρογόνων. Τέλος επιβεβαιώσαμε τα αποτελέσματα μας in vivo χρησιμοποιώντας 2 μοντέλα ανοσοκατεσταλμένων μυών το NOD SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J, Genotype: HOM Homozygous for Prkdcscid) και το R2G2 (B6.129-Rag2 tm1Fwa II2rg tm1Rsky /DwlHsd) και τα ορμονο- ευαίσθητα κύτταρα 22Rv1 για την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων. Στην ορμονο- ευαίσθητη κυτταρική σειρά 22Rv1 η έκθεση σε τεστοστερόνη οδήγησε σε αύξηση στον πολλαπλασιασμό και ισχυρή απόκριση των AR και AR-V7. Η τεστοστερόνη επίσης, αύξησε την έκφραση των πρωτεϊνών PSA και TMPRSS2 στα 22Rv1 κύτταρα, αλλά όχι στα PC3 και DU145 κύτταρα. Ακόμη, η Απαλουταμίδη παρουσίασε την πιο ισχυρή κατασταλτική δράση κατά του ανδρογονικού μονοπατιού και των καθοδικών πρωτεϊνών στα 22Rv1 κύτταρα. Ούτε η τεστοστερόνη, αλλά ούτε και τα αντιανδρογόνα επηρέασαν την έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την υποξία, τον αναερόβιο μεταβολισμό και την αυτοφαγία. Και τα τρία αντιανδρογόνα κατέστειλαν τον πολλαπλασιασμό/βιωσιμότητα και των τριών κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη σε παρόμοιες συγκεντρώσεις. Τα αντιανδρογόνα δεύτερης γενιάς (Απαλουταμίδη και Ενζαλουταμίδη), σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (100μM) κατέστειλαν σχεδόν τελείως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στην κυτταρική σειρά 22Rv1 και μείωσαν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό στις κυτταρικές σειρές PC3 και DU145. Τα πειράματα με την Ακτινοθεραπεία έδειξαν πως η Απαλουταμίδη και η Ενζαλουταμίδη έχουν ισχυρή ακτινευαισθητοποιό δράση και για τις τρεις κυτταρικές σειρές. Ένα ενδιαφέρον και προτόγνωρο πρότυπο κυτταρικού θανάτου παρατηρήθηκε και στις τρείς κυτταρικές σειρές όταν η ακτινοβολία συνδυάστηκε με την απαλουταμίδη και σε μικρότερο βαθμό με την ενζαλουταμίδη. Από το πρώτο μισάωρο μέχρι και τις 4 ώρες μετά την ακτινοβολία παρατηρήθηκε ρήξη του πυρήνα και έντονος εντοπισμός της ιστόνης γH2AX σε μεγάλες στρογγυλές δομές, οι οποίες υποδεικνύουν ένα συγκεκριμένο μοτίβο κυτταρικού θανάτου που περιλαμβάνει πυρηνικό κατακερματισμό (καρυόρηξη). Αυτός ο τύπος κυτταρικού θανάτου δεν σχτίστηκε με ενεργοποίηση αποπτωτικών μονοπατιών και δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα τα οποία δέχθηκαν μόνο ακτινοβολία ή ακτινοβολία σε συνδυασμό με Βικαλουταμίδη. Τα in vivo πειράματα έδειξαν ότι τόσο η απαλουταμίδη όσο και η Βικαλουταμίδη εμφάνισαν ισχυρή δράση ευαισθητοποίησης στην ακτινοβολία, μειώνοντας τον ρυθμό ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων σε σύγκριση με τα ξενομοσχεύματα στα οποία χορηγήθηκε ακτινοβολία μόνο. Συγκριτικά με την Βικαλουταμίδη, η Απαλουταμίδη παρουσίασε ισχυρότερη δράση. Επίσης, οι όγκοι που υποβλήθηκαν σε Ακτινοθεραπεία σε συνδυασμό με Απαλουταμίδη έδειξαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό νέκρωσης σε σύγκριση με όγκους που δέχτηκαν ακτινοθεραπεία μόνο ή ακτινοθεραπεία σε συνδυασμό με Βικαλουταμίδη. Τέλος, τα πειράματα χημειοευαισθητοποίησης έδειξαν ότι και τα τρία αντιανδρογόνα αύξησαν την κυτταροτοξική δράση της καμπαζιταξέλης σε κύτταρα 22Rv1, ενώ μόνο η Απαλουταμίδη και η Ενζαλουταμίδη είχαν το ίδιο αποτέλεσμα στα PC3 ορμονοάντοχα κύτταρα. Κανένα από τα αντιανδρογόνα που μελετήσαμε δεν έδειξε καμία συνδυαστική δράση με την καμπαζιταξέλη στη κυτταρική σειρά DU145. Η απαλουταμίδη ήταν το μόνο αντιανδρογόνο που ενίσχυσε την κυτταροτοξική δράση της δοσεταξέλης και μόνο σε κύτταρα 22Rv1. Συνολικά, δείξαμε ότι τα αντιανδρογόνα δεύτερης γενιάς (και ειδικά η Aπαλουταμίδη) έχουν πιο ισχυρή κατασταλτική δράση στο σηματοδοτικό μονοπάτι του AR και στην επαγώμενη από τεστοστερόνη έκφραση καθοδικών γονιδίων όπως το PSA και το TMPRSS2 σε σχέση με την Bικαλουταμίδη. Τα αντι-ανδρογόνα δεύτερης γενιάς ήταν επίσης ανώτερα στην καταστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι τα αντιανδρογόνα δεύτερης γενιάς ενισχύουν τη δράση της ακτινοβολίας έναντι των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, ανεξάρτητα από την έκφραση του AR. Τα in vivo πειράματα επιβεβαίωσαν πως η ακτινο-ευαισθητοποιητική δράση της Aπαλουταμίδης είναι σημαντικά ισχυρότερη από αυτή της Βικαλουταμίδης. Τα αποτελέσματα μας παρέχουν σημαντικά δεδομένα για τον μελλοντικό σχεδιασμό κλινικών δοκιμών για την συνδυαστική χρήση της ακτινοθεραπείας με τα αντιανδρογόνα δεύτερης γενιάς.