Effects of aging and lifelong exercise on the metabolic fingerprint and frailty status of rats

Abstract

Life expectancy has increased over the past decades, resulting in an increase in the number of aged individuals. Aging comes with a multitude of physical and mental deteriorations that lead to age-associated diseases and frailty. Regular exercise is an important part of a healthy lifestyle, as it helps maintain a healthy weight and reduces the risk of chronic diseases. Also, it is available to everyone, simple, inexpensive and non-invasive. These characteristics make it a highly effective form of lifestyle intervention and treatment of age-related disease. Metabolomics is an important tool in understanding the mechanisms regulating the responses of biological systems to natural processes (such as aging) and stimuli (such as exercise), as well as for detecting specific and sensitive biomarkers. The aim of the present thesis was to examine the effects of aging and lifelong exercise on the rat blood and urinary metabolomes through a metabolomics approach, on insulin sensitivity and on the muscle, liver and brain fatty acid composition. Thirty-six male Wistar rats were divided into four equal groups: exercise during the 1st half of life (3–12 months, A), lifelong exercise (3–21months, B), no exercise (C), and exercise during the 2nd half of life (12–21 months, D). Exercise consisted in swimming for 20 minutes, five times a week. Blood and urine samples were collected at 3 months of age (before the beginning of exercise), at 12 months and at 21 months. Urine samples were additionally collected before and 1 h after an exercise session at 3 and 12 months of age. Insulin sensitivity was assessed by the blood glucose response to an insulin bolus injection on the 21st month, one week after the last exercise session of the exercising groups. The lifelong and no-exercise groups were afterwards subjected to the same exercise acutely and insulin sensitivity was assessed 1, 3, 5 and 7 days post-exercise. Seventeen days after the last exercise session of group D, the rats of groups A and D were euthanised and their quadriceps, liver and brain were collected. The same was done with groups B and C, 3 months after the last exercise session of group B. A total of 101 deproteinized whole-blood samples were analysed by proton nuclear magnetic resonance, which identified 39 metabolites. A total of 141 urine samples were analysed using targeted metabolomic analysis by liquid chromatography – mass spectrometry, which identified 51 metabolites. Twenty-four samples of quadriceps, 24 samples of liver and 22 samples of brain were analysed for the fatty-acid composition of triacylglycerols and phospholipids by thin-layer chromatography – gas chromatography. Data were analysed by multivariate methods (PCA, PLS-DA and OPLS) and by univariate methods (repeated-measures ANOVA and Student’s t test). The groups that exercised during the 2nd half of life weighed less than the groups that did not. Exercise had an orexigenic effect during the 1st half and an anorexigenic effect during the 2nd half. Multivariate analysis did not show any discrimination between groups at any of the three ages, in either blood or urine. However, it showed a clear discrimination between ages when the groups were treated as one, in both biofluids. Univariate analysis showed different effects of exercise and aging on metabolites involved in carbohydrate (glucose, pyruvate, acetylcarnitine), lipid (glycerol, acetylcarnitine) and protein (several amino acids and their derivatives) metabolism. Interestingly, although exercise had a profound effect on the metabolome at an early age (i.e., between 3 and 12 months), this effect tended to fade at an older age (i.e,, between 12 and 21 months). Insulin sensitivity did not differ among groups, suggesting either no prolonged effect of exercise or no effect at all. Moreover, compared to baseline, insulin sensitivity was higher at 1 and 3, but not at 5 or 7 days post-exercise. Multivariate analysis showed a discrimination between groups A and D in quadriceps triacylglycerol fatty acids and in both phospholipid and triacylglycerol fatty acids of the liver. Univariate analysis showed a decrease in some saturated and monounsaturated fatty acids, and an increase in polyunsaturated fatty acids. On the other hand, multivariate analysis did not show any discrimination between groups B and C on any lipid parameter. In conclusion, moderate-intensity exercise for life or half-life had strong and potentially healthful effects on body weight and (partly) appetite, as well as on some blood and urinary metabolites. The effects of aging on the blood and urinary metabolome seemed to be stronger than those of exercise. Furthermore, exercise appeared to exert an acute, not chronic, effect on insulin sensitivity which wore off between 3 and 5 days post-exercise. Finally, exercise during the 2nd half seemed to enhance the abundance of the vital polyunsaturated fatty acids. The opposite effect on saturated and monounsaturated fatty acids may be due to a higher utilisation of these fatty acid categories in exercise. Three months of detraining, however, annihilated the effects of exercise on the fatty-acid profiles of aged rats.

Το προσδόκιμο ζωής έχει αυξηθεί τις τελευταίες δεκαετίες, με αποτέλεσμα να αυξηθεί ο αριθμός των ηλικιωμένων ατόμων. Η προχωρημένη ηλικία συνοδεύεται από πληθώρα σωματικών και νοητικών αλλοιώσεων, που οδηγούν σε ασθένειες σχετιζόμενες με τη γήρανση και τη γεροντική αδυναμία. Η τακτική άσκηση είναι αναπόσπαστο μέρος ενός υγιεινού τρόπου ζωής, καθώς βοηθά στη διατήρηση υγιούς σωματικού βάρους και μειώνει τον κίνδυνο εμφάνισης χρόνιων παθήσεων. Επίσης, είναι διαθέσιμη σε όλους, απλή, φθηνή και μη παρεμβατική. Αυτά τα χαρακτηριστικά την καθιστούν μια πολύ αποτελεσματική μορφή παρέμβασης στον τρόπο ζωής και θεραπείας ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία. Η μεταβολομική είναι ένα σημαντικό εργαλείο για την κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν τις αποκρίσεις των βιολογικών συστημάτων στις φυσικές διεργασίες (όπως η γήρανση) και φυσικά ερεθίσματα (όπως η άσκηση), καθώς και για την ανίχνευση συγκεκριμένων και ευαίσθητων βιοδεικτών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η εξέταση των επιδράσεων της γήρανσης και της δια βίου άσκησης στο μεταβόλωμα του αίματος και των ούρων αρσενικών επιμύων μέσω μιας μεταβολομικής προσέγγισης, στην ευαισθησία στην ινσουλίνη και στη σύσταση λιπαρών οξέων του μυός, του ήπατος και του εγκεφάλου. Τριανταέξι αρσενικοί επίμυες της φυλής Wistar χωρίστηκαν σε τέσσερις ίσες ομάδες: άσκησης κατά το 1ο μισό της ζωής (3-12 μήνες, Α), δια βίου άσκησης (3-21 μήνες, Β), μη άσκησης (C) και άσκησης κατά το 2ο μισό της ζωής (12-21 μήνες, D). Η άσκηση περιλάμβανε κολύμβηση για 20 λεπτά, πέντε φορές την εβδομάδα. Δείγματα αίματος και ούρων συλλέχθηκαν σε ηλικία 3 μηνών (πριν από την έναρξη της άσκησης), 12 μηνών και 21 μηνών. Δείγματα ούρων συλλέχθηκαν επίσης πριν και μία ώρα μετά από μια συνεδρία άσκησης σε ηλικία 3 και 12 μηνών. Η ευαισθησία στην ινσουλίνη αξιολογήθηκε μέσω της απόκριση της γλυκόζης του αίματος σε μια ένεση ινσουλίνης τον 21ο μήνα, μία εβδομάδα μετά την τελευταία συνεδρία των ασκούμενων ομάδων. Η ομάδα δια βίου άσκησης και η ομάδα μη άσκησης υποβλήθηκαν κατόπιν στην ίδια οξεία άσκηση και η ευαισθησία στην ινσουλίνη αξιολογήθηκε 1, 3, 5 και 7 ημέρες μετά την άσκηση. Δεκαεπτά ημέρες μετά την τελευταία συνεδρία άσκησης της ομάδας D οι επίμυες των ομάδων A και D θανατώθηκαν και συλλέχθηκαν ο τετρακέφαλος μυς, το ήπαρ και ο εγκέφαλός τους. Το ίδιο πραγματοποιήθηκε και με τις ομάδες B και C, 3 μήνες μετά την τελευταία συνεδρία άσκησης της ομάδας Β. Συνολικά 101 δείγματα αποπρωτεϊνωμένου αίματος αναλύθηκαν με τη μέθοδο του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου, με την οποία ταυτοποιήθηκαν 39 μεταβολίτες. Συνολικά 141 δείγματα ούρων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση με υγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μάζας, όπου ταυτοποιήθηκαν 51 μεταβολίτες. Εικοσι τέσσερα δείγματα τετρακεφάλου, 24 δείγματα ήπατος και 22 δείγματα εγκεφάλου αναλύθηκαν ως προς τη σύσταση λιπαρών οξέων των τριακυλογλυκερολών και φωσφολιπιδίων με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας – αέρια χρωματογραφία. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά με πολυμεταβλητές μεθόδους (PCA, PLS-DA και OPLS) και με μονομεταβλητές μεθόδους (ANOVA με επαναλαμβανόμενες μετρήσεις και δοκιμασία t του Student). Οι ομάδες που ασκήθηκαν κατά το 2ο μισό της ζωής τους ζύγιζαν λιγότερο από τις ομάδες που δεν ασκήθηκαν. Η άσκηση είχε ορεξιγόνα δράση κατά το 1ο μισό και ανορεξιγόνα κατά το 2ο μισό. Η πολυμεταβλητή ανάλυση δεν διαχώρισε τις τέσσερις ομάδες σε οποιαδήποτε από τις τρεις ηλικίες, ούτε στο αίμα, ούτε και στα ούρα. Ωστόσο, διαχώρισε ξεκάθαρα τις τρεις ηλικίες, όταν οι ομάδες αντιμετωπίστηκαν ως μία, και στα δύο βιολογικά υγρά. Η μονομεταβλητή ανάλυση έδειξε διαφορετικές επιδράσεις της άσκησης και της γήρανσης σε μεταβολίτες που εμπλέκονται στον μεταβολισμό των υδατανθράκων (γλυκόζη, πυροσταφυλικό, ακετυλοκαρνιτίνη), των λιπιδίων (γλυκερόλη, ακετυλοκαρνιτίνη) και των πρωτεϊνών (αμινοξέα και τα παράγωγά τους). Ενδιαφέρον προκαλεί το ότι, παρότι η άσκηση είχε έντονη επίδραση στο μεταβόλωμα σε νεαρή ηλικία (δηλαδή μεταξύ 3 και 12 μηνών), αυτή η επίδραση έτεινε να εξασθενεί σε μεγαλύτερη ηλικία (δηλαδή μεταξύ 12 και 21 μηνών). Η ευαισθησία στην ινσουλίνη δε διέφερε μεταξύ των ομάδων, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν υπήρχε παρατεταμένη επίδραση της άσκησης ή ακόμα και καθόλου επίδραση. Επίσης, συγκριτικά με τις αρχικές τιμές, η ευαισθησία στην ινσουλίνη ήταν υψηλότερη την 1η και 3η, αλλά όχι την 5η ή 7η ημέρα μετά την άσκηση. Η πολυμεταβλητή ανάλυση διέκρινε τις ομάδες Α και D ως προς τα λιπαρά οξέα των τριακυλογλυκερολών του τετρακεφάλου και τα λιπαρά οξέα των φωσφολιπιδίων και τριακυλογλυκερολών του ήπατος. Η μονομεταβλητή ανάλυση έδειξε μείωση ορισμένων κορεσμένων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων και αύξηση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Από την άλλη πλευρά, η πολυμεταβλητή ανάλυση δεν διέκρινε τις ομάδες Β και C ως προς οποιαδήποτε λιπιδική παράμετρο. Συμπερασματικά, η δια βίου ή μακροχρόνια άσκηση μέτριας έντασης είχε ισχυρές και δυνητικά ωφέλιμες για την υγεία επιδράσεις στο σωματικό βάρος και (εν μέρει) στην όρεξη, καθώς και σε ορισμένους μεταβολίτες του αίματος και των ούρων. Οι επιδράσεις της γήρανσης στο μεταβόλωμα του αίματος και των ούρων φάνηκε να είναι ισχυρότερες από εκείνες της άσκησης. Επιπλέον, η άσκηση φάνηκε να ασκεί οξεία, αλλά όχι χρόνια επίδραση στην ευαισθησία στην ινσουλίνη, ευαισθησία που εξασθένησε μεταξύ της 3ης και 5ης ημέρας μετά την άσκηση. Τέλος, η άσκηση κατά το 2ο μισό φάνηκε να αυξάνει την αφθονία των ζωτικών πολυακόρεστων λιπαρών. Η αντίθετη επίδραση στα κορεσμένα και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα ίσως οφείλεται σε υψηλότερη χρήση των συγκεκριμένων κατηγοριών λιπαρών οξέων κατά την άσκηση. Μετά όμως από τρεις μήνες αποπροπόνησης, οι επιδράσεις της άσκησης στο προφίλ λιπαρών οξέων των ηλικιωμένων επιμύων εξαφανίστηκαν.