Μελέτη του ρόλου των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της Rab5 στα μονοπάτια ενδοκυττάρωσης ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων: μελέτη του ρόλου της αλληλεπίδρασης μεταξυ Rab5 και ACAT2 στην ενδοκυττάρωση

Abstract

Endocytosis is a complex process via which segments of the plasma membrane and extracellular nutrients are internalized via vesicular carriers towards the endolysosomal system. This trafficking pathway is subject to regulation by Rab GTPases. The small GTPase Rab5, regulates membrane traffic towards and between early endosomes, and is necessary for the biogenesis of the endolysosomal system. To regulate the above processes, Rab5 functions as a molecular switch by alternating between active GTP- and inactive GDP-bound states. An appealing question in the field is how Rab5 regulates the multiple complex steps of endocytosis. In a previous study, a large set of over 40 proteins interacting with Rab5-GTP were isolated using Rab5-affinity chromatography andidentified by mass spectroscopy, while only one protein was found to interact with Rab5-GDP. By Mass-spectrometry, we identified this new protein as the cytoplasmic Acetoacetyl-CoA Thiolase 2 (ACAT2), an enzyme that catalyzes the conversion of acetyl-CoA to acetoacetylCoA, the first reaction of the mevalonate pathway. Besides, ACAT2 has been recently characterized as a new cytoplasmic protein acetyl-transferase. The specificity of the Rab5- ACAT2 interaction was confirmed by employing an affinity chromatography approach, using different members of the Rab family (such as Rab4 and Rab27). To assess the strength and the kinetics of ACAT2-Rab5 interaction, isothermal titration calorimetry (ITC) experiments were performed for ACAT2 and Rab5-GDP. The data suggest that binding of ACAT2 to Rab5- GDP, is a thermodynamically favored, yet weak, interaction, with a Kd at the scale of μΜ, which is rather typical for protein-protein interactions forming dynamic regulatory networks. To get insights into the significance of the interaction between Rab5 and ACAT2, at first, we confirmed the GDP-dependent binding between these two proteins in intact cells. To this end, we found that targeting of wild type Rab5 to the cytoplasmic surface of mitochondria (using a mitochondrial targeting signal) was able to relocate endogenous ACAT2 from the cytoplasm to the mitochondrial membrane. Furthermore, using an in vitro endosome fusion assay, we found that ACAT2 inhibits Rab5-mediated early endosome fusion, suggesting that it exerts an inhibitory role on Rab5. Consistently, we found that knock down of ACAT2 accelerates the internalization and degradation of VEGFR2 in HUVEC. Moreover, knock down of ACAT2 augments the number of early endosomes and lysosomes, in HUVE and HepG2 cells. Finally, by mass spectrometry we identified that ACAT2 acetylates Rab5-GDP in vitro. Taken together, these data suggest that ACAT2 is a new and critical regulator of Rab5 in the endocytic pathway. Ongoing work in the lab aims to shed light on the mechanism of the ACAT2-Rab5 interaction and its role in the interconnection between endocytosis, signaling and metabolism.

Η ενδοκυττάρωση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία μέσω της οποίας τμήματα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και εξωκυττάριες θρεπτικές ουσίες εισέρχονται στο κύτταρο μέσω κυστιδίων τα οποία οδηγούνται στο ενδολυσοσωματικό σύστημα. Καθοριστικό ρόλο στην διακίνηση του εσωτερικευμένου φορτίου παίζουν οι Rab GTPασες. Η μικρή GTPαση Rab5 ρυθμίζει την κυστιδιακή διακίνηση προς τα πρώιμα ενδοσώματα αλλά και μεταξύ αυτών, και παίζει σημαντικό ρόλο στην βιογένεση του ενδολυσοσωματικού συστήματος . Για να ρυθμίσει η Rab5 τις παραπάνω λειτουργίες της εναλλάσσεται μεταξύ της GTP ενεργούς διαμόρφωσης και της GDP ανενεργούςδιαμόρφωσης. Ενδιαφέρον προκαλεί το πώς η Rab5 ρυθμίζει τα πολύπλοκα και σύνθετα στάδια της ενδοκυττάρωσης. Σε προηγούμενες μελέτες, αναπτύχθηκε μια μεθοδολογία χρωματογραφίας συγγένειας με την οποία ταυτοποιήθηκαν περισσότερες από 40 πρωτεΐνες που συνδέονται με την Rab5-GTP, ενώ μόλις μία πρωτεΐνη βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την Rab5-GDP. Με φασματομετρία μάζας ταυτοποιήσαμε την κυτταροπλασματική ακετυλο-CoA θειολάση 2 (ACAT2), ένα ένζυμο που καταλύει την μετατροπή του ακέτυλο-CoA σε ακετοακέτυλο-CoA, δηλαδή την πρώτη αντίδραση στο μονοπάτι του μεβαλονικού οξέος. Επιπλέον, η ACAT2 είναι ακετυλοτρανφεράση πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Με δοκιμασίες χρωματογραφίας συγγένειας (pull-down) επιβεβαιώθηκε η εξειδίκευση της πρόσδεσης της ACAT2 στην Rab5, έναντι άλλων μελών της οικογένειας των Rabs (όπως η Rab4 και Rab27). Στη συνέχεια, μελετήσαμε την σταθερά σύνδεσης μεταξύ των Rab5-GDP και ACAT2 ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με την μέθοδο ισοθερμικής τιτλοδότησης (ITC), και διαπιστώσαμε ότι πρόκειται για μια ευνοούμενη θερμοδυναμικά, ασθενή σύνδεση, με Kd της τάξεως των μΜ, η οποία είναι τυπική για αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών που σχηματίζουν δυναμικά πρωτεϊνικά δίκτυα. Προκειμένου να διαλευκάνουμε τη σημασία της αλληλεπίδρασης μεταξύ Rab5 καιACAT2, αρχικά, αποδείξαμε ότι η σύνδεση μεταξύ Rab5-GDP και ACAT2 μπορεί να συμβεί σε ανέπαφα κύτταρα. Πράγματι, πραγματοποιώντας τεχνητή μετατόπιση της Rab5 άγριου τύπου στην κυτταροπλασματική επιφάνεια των μιτοχονδρίων (χρησιμοποιώντας ένα σήμα μιτοχονδριακής στόχευσης), προκλήθηκε μετακίνηση της ενδογενούς ACAT2 από το κυτταρόπλασμα, στη μιτοχονδριακή μεμβράνη. Ακολούθως, χρησιμοποιώντας μία in vitro δοκιμασία σύντηξης ενδοσωμάτων, αποδείξαμε ότι η ACAT2 αναστέλλει τη Rab5- μεσολαβούμενη σύντηξη των πρώιμων ενδοσωμάτων, υποδηλώνοντας ότι ασκεί ανασταλτικό ρόλο στην Rab5. Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε ότι η μείωση των επιπέδων της ACAT2 επιταχύνει την εσωτερίκευση και την αποικοδόμηση του VEGFR2 σε κύτταρα HUVE. Επιπλέον, η μείωση των επιπέδων της ACAT2 προκαλεί αύξηση του αριθμού των πρώιμων ενδοσωμάτων και λυσοσωμάτων σε κύτταρα HUVE και HepG2. Τέλος, με φασματομετρία μάζας ταυτοποιήσαμε την in vitro ακετυλίωση της Rab5-GDP από την ACAT2. Συνοψίζοντας τα δεδομένα της παρούσας διατριβής, συμπεραίνουμε ότι η ACAT2 είναι μια νέα πρωτεΐνηρυθμιστής της Rab5 και παίζει σημαντικό ρόλο στο μονοπάτι της ενδοκυττάρωσης. Τέλος,μελλοντικά πειράματα θα συμβάλλουν στην περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού της αλληλεπίδρασης, και θα διαλευκάνουν τον ακριβή ρόλο της στην διασύνδεση μεταξύ μεταβολισμού, ενδοκυττάρωσης και μεταγωγής του σήματος.