Επίδραση φυσιολογικών και παθολογικών παραγόντων σε αιματολογικές παραμέτρους των μηρυκαστικών

Abstract

This thesis aimed to assess the effect of physiological factors that act before or during the complete blood count analysis, as well as pathological factors which can affect the hematological variables of ruminants. Among these factors, three physiological, two pre-analyticals (age, B12-rumen function) and one analytical (method), as well as one pathological factor (Anaplasma phagocytophilum), were selected and assessed. In Chapter I, the literature regarding the factors having an impact on the values of the hematological variables of ruminants are thoroughly reviewed. More specifically, factors acting at the pre-analytical, analytical or post-analytical phase and could alter the results of hematological variables are reported. In addition, the main pathological factors that affect blood cell counts and morphology of ruminants and the changes that are observed are presented. Their classification is based on the type of cells that undergo the most significant changes. In Chapter II, B12 synthesis, metabolism, function, requirements and the effect of B12 deficiency or toxicosis on ruminant health, are briefly reported. The study presented in this chapter regards the comparison of the concentrations of vitamin B12 and the values of hematological variables before and after weaning in veal calves and the investigation of the correlation between the concentration of vitamin B12 in blood and the hematological variables in calves before and after weaning. To this aim, blood was collected form 31 pre-weaned and 31 weaned calves of Limousine breed from the same farm. Complete blood count was performed in automated hematological analyzer and by blood smear evaluation and serum B12, total protein and albumin concentrations were measured. The serum concentration of vitamin B12, the HCT, the HGB, the platelet count and the lymphocyte count were significantly higher in weaned compared to pre-weaned calves. A very strong positive correlation was found between the concentration of vitamin B12 and HCT and HGB before weaning while these correlations were moderate positive after weaning and in the total population tested as well. In Chapter III, methods for the determination of the complete blood cell count in automatic hematological analyzers are described. Subsequently, the comparative study on WBC and platelet count determination is reported. The aim of this study was the comparison of the results of the WBC count evaluated microscopically in blood smears with those obtained by ADVIA 120 hematology analyzer and the validation of the appropriate correction factors for the manual technique, as well as the assessment of two suggested factors for platelet calculation in blood smears in sheep. In order to generate the regression equation between the average WBC count per field and the WBC count determined by ADVIA 120, 57 ovine blood samples were used. Then, 31 new ovine samples were used for the assessment of the agreement between the calculated WBC count based on the generated equation and those obtained by the analyzer. Similarly, agreement between platelet count using two different factors for platelet calculation was assessed. Average bias of calculated WBC count was 0.4% with precision and accuracy over 95%. Regarding calculated platelet count a bias of 26.4% and 1.4% was revealed when the average number of platelets per field was multiplied by 15,000 and 20,000 respectively. In Chapter IV, at first, the infection and/or the disease caused by the Anaplasma phagocytophilum in ruminants including transmission, pathogenesis and diagnosis are briefly reviewed. The study presented in this chapter concerns the investigation of the effect of the presence of antibodies or the antigen of A. phagocytophilum on serological, and/or cytological examination, respectively, on the blood cell count and morphology in sheep. To this aim 138 sheep with tick infestation were blood sampled for the determination of the main hematological variables (PCV, WBC and differential WBC count, PLT count and blood cell morphology) as well as for the detection of the presence of antibodies and/or antigen in their blood, employing an indirect immunofluorescent assay and buffy coat blood smear microscopy, respectively. The sheep were divided into four groups (A, B, C, D) depending on the presence or absence of antibodies or/and antigen in their blood. Sheep found positive only in the presence of the antigen showed mild anemia, leukopenia (mainly lymphopenia) and thrombocytopenia. Positive sheep in both methods showed anemia, leukopenia (neutropenia and lymphopenia) and thrombocytopenia. Sheep that were positive only for antibody detection showed mild leukopenia. In the Groups A and B, activated lymphocytes and monocytes were observed, while in Group C only a few activated monocytes were observed. In Group B a higher number of band neutrophils was found and a toxic neutrophil in the blood smear was present. The findings of this thesis are the followings: a) the observed variation in the hematological variables with age seems to be related with vitamin B12 concentration. Moreover, vitamin B12 is higher in weaned calves that vitamin B12 is synthesized in rumen compared to pre-weaned calves that depend on the intake of vitamin B12 from external sources, mainly milk. b) microscopic counting of WBCs in ovine blood is a reliable alternative to automated analysis using the generated equation. A better agreement between the two methods was observed when the factor 20,000 was used for the calculation of platelet count in ovine blood smear. c) iInfection or/and exposure of sheep to A. phagocytophilum is accompanied by quantitative changes in all blood cells, as well as changes in the morphology of white blood cells. In this study, quantitative changes in all blood cells were found, as well as changes in the morphology of white blood cells. The results of the complete blood count in combination with the cytological and serological tests for the detection of the microorganism or the antibodies, respectively, can contribute to the assessment of the stage of the disease. From a clinical point of view, the compromised cellular immunity, found during the simultaneous detection of microorganisms and antibodies, shows that during this period the animals are more susceptible and therefore need to be monitored for early treatment of secondary complications. Also, the combination of leukopenia and thrombocytopenia is the most important laboratory finding that raises the suspicion of the disease. The changes found are indicative of an inflammatory reaction, antigenic stimulation, and stress. These findings add to the knowledge of the pathogenetic mechanisms of A. phagocytophilum infection in sheep and highlight the value of the complete blood cell count and the evaluation of cell morphology in monitoring disease progression.

Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στην αξιολόγηση φυσιολογικών παραγόντων, που δρουν πριν ή κατά τη διάρκεια της ανάλυσης των δειγμάτων αίματος καθώς και παθολογικών παραγόντων, που μπορούν να επηρεάσουν τις αιματολογικές παραμέτρους των μηρυκαστικών. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν και αξιολογήθηκε η δράση τριών φυσιολογικών παραγόντων, δύο προαναλυτικών (ηλικία, βιταμίνη Β12- λειτουργία μεγάλης κοιλίας) και ενός αναλυτικού (μέθοδος), καθώς και ενός παθολογικού παράγοντα (Anaplasma phagocytophilum). Στο Κεφάλαιο Ι, ανασκοπείται η σχετική βιβλιογραφία που αφορά στους παράγοντες που μεταβάλλουν τις τιμές των αιματολογικών παραμέτρων των μηρυκαστικών. Πιο συγκεκριμένα γίνεται ανάλυση των παραγόντων που επιδρούν πριν, κατά τη διάρκεια ή μετά την ανάλυση των δειγμάτων του αίματος και μπορούν να επηρεάσουν το τελικό αποτέλεσμα των αιματολογικών εξετάσεων. Επιπλέον αναφέρονται οι κυριότεροι παθολογικοί παράγοντες που προκαλούν ποσοτικές και μορφολογικές μεταβολές των κυττάρων του αίματος των μηρυκαστικών. Η κατηγοριοποίησή τους γίνεται με βάση το είδος των κυττάρων που υφίσταται τη σημαντικότερη μεταβολή. Στο Κεφάλαιο II, γίνεται ανασκόπηση της σύνθεσης, του μεταβολισμού, της λειτουργίας, των αναγκών, των επιπτώσεων στη υγεία των μηρυκαστικών τόσο της ανεπάρκειας όσο και της τοξίκωσης από τη βιταμίνη Β12. Στη συνέχεια περιγράφεται η μελέτη της επίδρασης της ηλικίας και της Β12 στις αιματολογικές παραμέτρους των μόσχων. Για τη μελέτη αυτή συλλέχθηκε αίμα από 31 μόσχους πριν και 31 μόσχους μετά τον απογαλακτισμό, φυλής Limousine από την ίδια εκτροφή. Στα ζώα αυτά, πραγματοποιήθηκε γενική εξέταση του αίματος σε αυτόματο αιματολογικό αναλυτή και εκτίμηση του επιχρίσματος του αίματος και προσδιορίσθηκαν οι συγκεντρώσεις της βιταμίνης Β12, των ολικών πρωτεϊνών και των λευκωματινών. Η συγκέντρωση της βιταμίνης Β12 στον ορό του αίματος, ο αιματοκρίτης, η αιμοσφαιρίνη, ο αριθμός των αιμοπεταλιών και των λεμφοκυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερα στους απογαλακτισμένους μόσχους απ’ ότι στους μη- απογαλακτισμένους. Πολύ ισχυρή θετική συσχέτιση υπήρξε μεταξύ της συγκέντρωσης της βιταμίνης Β12 και του αιματοκρίτη καθώς και της αιμοσφαιρίνης πριν τον απογαλακτισμό, ενώ αυτές οι συσχετίσεις ήταν μέτρια θετικές μετά τον απογαλακτισμό, όπως και στον ολικό πληθυσμό. Στο Κεφάλαιο ΙΙΙ περιγράφονται μέθοδοι προσδιορισμού της μάζας κάθε είδους κυττάρων του αίματος στους αυτόματους αιματολογικούς αναλυτές. Στη συνέχεια περιγράφεται η μελέτη σύγκρισης δύο διαφορετικών μεθόδων προσδιορισμού των τιμών των λευκών αιμοσφαιρίων και των αιμοπεταλίων. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η σύγκριση των αποτελεσμάτων του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων ύστερα από προσδιορισμό του με μικροσκοπική εξέταση του επιχρίσματος αίματος και με τον αυτόματο αιματολογικό αναλυτή ADVIA 120, καθώς και προσδιορισμός του κατάλληλου διορθωτικού παράγοντα της μεθόδου υπολογισμού του αριθμού των WBCs με τη μικροσκοπική εξέταση του επιχρίσματος. Επιπλέον, σκοπός της μελέτης ήταν και η αξιολόγηση δύο προτεινόμενων παραγόντων για τον υπολογισμό του αριθμού των αιμοπεταλίων στα επιχρίσματα αίματος των προβάτων. Προκειμένου να δημιουργηθεί η εξίσωση παλινδρόμησης μεταξύ του μέσου αριθμού των WBCs ανά πεδίο και του αριθμού των WBCs που προσδιορίζεται από τον ADVIA 120, χρησιμοποιήθηκαν 57 δείγματα αίματος προβάτων. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν 31 νέα δείγματα προβάτων για την αξιολόγηση της συμφωνίας μεταξύ του υπολογιζόμενου αριθμού των WBCs βάσει της δημιουργηθείσας εξίσωσης και εκείνων που ελήφθησαν από την ανάλυση. Ομοίως, αξιολογήθηκε η συμφωνία μεταξύ του αριθμού των αιμοπεταλίων με τη χρήση δύο διαφορετικών παραγόντων για τον υπολογισμό του αριθμού των αιμοπεταλίων. Η απόκλιση ανάμεσα στις τιμές των WBCs που υπολογίστηκαν με τις δύο μεθόδους ήταν 0,4% με αξιοπιστία και ακρίβεια πάνω από 95%. Όσον αφορά στον υπολογισμό του αριθμού των αιμοπεταλίων με τους δύο παράγοντες, η στατιστική απόκλιση ήταν 26,4% και 1,4%, όταν ο αριθμός των αιμοπεταλίων ανά οπτικό πεδίο πολλαπλασιάστηκε με 15.000 και 20.0000, αντίστοιχα. Στο Κεφάλαιο IV αρχικά, γίνεται σύντομη ανασκόπηση της αναπλάσμωσης που προκαλείται από το βακτήριο Anaplasma phagocytophilum στα μηρυκαστικά και ιδιαίτερα της μετάδοσης, της παθογένειας και των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση. Η μελέτη που παρουσιάζεται στο κεφάλαιο αυτό είχε σκοπό την αξιολόγηση τυχόν επίδρασης της παρουσίας αντισωμάτων ή αντιγόνου του A. phagocytophilum στην ορολογική ή/και στην κυτταρολογική εξέταση, αντίστοιχα και στον αριθμό και τη μορφολογία των κυττάρων του αίματος των προβάτων. Για το σκοπό αυτό συλλέχθηκε αίμα από 138 πρόβατα παρασιτούμενα από κρότωνες. Στα δείγματα αίματος προσδιορίστηκαν οι κύριες αιματολογικές παράμετροι (αιματοκρίτης, αριθμός λευκών αιμοσφαιρίων, λευκοκυτταρικός τύπος, αριθμός αιμοπεταλίων και μορφολογία των κυττάρων) καθώς και η ανίχνευση αντισωμάτων ή αντιγόνου στο αίμα, με τις μεθόδους του έμμεσου ανοσοφθορισμού και της μικροσκοπικής εξέτασης του επιχρίσματος της στοιβάδας των λευκών και των αιμοπεταλίων, αντίστοιχα. Τα πρόβατα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (Α, Β, Γ, Δ) ανάλογα με την παρουσία ή όχι αντισωμάτων ή/και αντιγόνου στο αίμα τους. Τα πρόβατα που βρέθηκαν θετικά μόνο στην παρουσία του αντιγόνου εμφάνισαν ήπια αναιμία, λευκοπενία (κυρίως λεμφοπενία) και θρομβοκυτταροπενία. Τα πρόβατα που ήταν θετικά και στις δύο μεθόδους εμφάνισαν αναιμία, λευκοπενία (ουδετεροπενία και λεμφοπενία) και θρομβοκυτταροπενία. Τα πρόβατα που ήταν θετικά μόνο στην ανίχνευση των αντισωμάτων εμφάνισαν ήπια λευκοπενία. Στις Ομάδες Α και Β παρατηρήθηκαν ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα, ενώ στην τρίτη ομάδα μόνο λίγα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα. Στην Ομάδα Β διαπιστώθηκε μεγαλύτερος αριθμός άωρων ουδετεροφίλων και η παρουσία ενός τοξικού ουδετερόφιλου στο επίχρισμα του αίματος. Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τα ευρήματα αυτής της διατριβής, είναι τα εξής: α) η παρατηρούμενη διακύμανση των αιματολογικών παραμέτρων με την ηλικία φαίνεται να σχετίζεται με τη συγκέντρωση της βιταμίνης Β12. Επιπλέον, η βιταμίνη Β12 είναι υψηλότερη στους απογαλακτισμένους μόσχους, στους οποίους γίνεται σύνθεση της βιταμίνης Β12 στη μεγάλη κοιλία σε σύγκριση με τους μη-απογαλακτισμένους μόσχους οι οποίοι προσλαμβάνουν εξωγενώς τη βιταμίνης Β12, κυρίως με το γάλα. β) ο προσδιορισμός των λευκών αιμοσφαιρίων στο αίμα των προβάτων με τη μικροσκοπική μέθοδο είναι μια αξιόπιστη εναλλακτική λύση της χρήσης των αυτοματοποιημένων αιματολογικών αναλυτών χρησιμοποιώντας τη δημιουργηθείσα εξίσωση. Ο πολλαπλασιασμός του αριθμού των αιμοπεταλίων ανά πεδίο με τον παράγοντα 20.000 υπερτερεί σε σχέση με τον παράγοντα 15.000, για τον προσδιορισμό των αιμοπεταλίων. γ) η μόλυνση ή/και η έκθεση των προβάτων στο A. phagocytophilum συνοδεύεται από ποσοτικές μεταβολές όλων των κυττάρων του αίματος, αλλά και μεταβολές στη μορφολογία των λευκών αιμοσφαιρίων. Τα αποτελέσματα των αιματολογικών εξετάσεων σε συνδυασμό με τις κυτταρολογικές και ορολογικές εξετάσεις για την ανίχνευση του μικροοργανισμού ή των αντισωμάτων, αντίστοιχα, μπορούν να συμβάλλουν στην εκτίμηση του σταδίου του νοσήματος. Από κλινικής άποψης, η μειωμένη κυτταρική ανοσία (λευκοπενία) που διαπιστώθηκε στο διάστημα που εντοπίζονται ταυτόχρονα ο μικροοργανισμός και τα αντισώματα, δείχνει ότι την περίοδο αυτή τα ζώα είναι πιο ευάλωτα και συνεπώς χρειάζεται παρακολούθηση για την έγκαιρη αντιμετώπιση δευτερογενών επιπλοκών. Επίσης, ο συνδυασμός λευκοπενίας και θρομβοκυτταροπενίας είναι το σημαντικότερο εργαστηριακό εύρημα που θέτει υποψία της νόσου. Οι μεταβολές που διαπιστώθηκαν είναι ενδεικτικές φλεγμονώδους αντίδρασης, αντιγονικής διέγερσης και καταπόνησης. Τα ευρήματα αυτά προσθέτουν στη γνώση των παθογενετικών μηχανισμών της αναπλάσμωσης των προβάτων και αναδεικνύουν την αξία της γενικής εξέτασης του αίματος και της αξιολόγησης της μορφολογίας των κυττάρων στην παρακολούθηση της εξέλιξης του νοσήματος.