Διασπορά των σκληρών κροτώνων (Ixodidae) στην Ελλάδα και ο ρόλος αυτών στην επιδημιολογία του αιμορραγικού πυρετού Κριμαίας-Κονγκό

Abstract

Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) is a severe acute febrile illness often accompanied by hemorrhagic manifestations; the fatality rate ranges between 5% - 30%. The causative agent is the Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV, genus Orthonairovirus, family Nairoaviridae). It is transmitted to humans by bites of infected ticks, mainly of the Hyalomma genus, or by direct contact with blood or tissues of patients or livestock at viremic phase. CCHFV is the most widespread tick-borne viral disease and has been reported in more than 30 countries in Africa, Asia, Eastern and Southern Europe and the Middle East. The disease has a wide distribution that correlates with the global distribution of Hyalomma ticks (50o north latitude limit). Nine genetic clades are currently recognized (four from Africa, three from Europe and two from Asia), which present a geographic correlation: “Africa 1”, “Africa 2”, “Africa 3” and “Africa 4” with strains from Central and South Africa; “Asia 1” from Middle East; “Asia 2” from China, Tajikistan, Kazakhstan and Uzbekistan; “Europe 1” from Balkan peninsula, Russia and Turkey; “Europe 2” consisting of the AP92 strain from Greece and “Europe 3” with strains from Russia. The strains that are circulating in Greece belong to the lineages “Europe 1” and “Europe 2” which differ genetically and in virulence level. The only human (fatal) case was reported in June 2008 and the strain belonged to lineage “Europe 1”, while the AP92 strain which belongs to lineage “Europe 2”, was isolated in 1975 from R. bursa ticks collected from goats in Vergina village in Central Macedonia. The purpose of the present study was to provide an overview on the prevalence and distribution of tick species in various regions of Greece (especially in areas where seroprevalence studies in humans have been previously performed), to identify the geographical parameters of the tick collection sites through the use of geographic and spatial analysis systems (GIS-SA), to estimate the CCHFV infection rate in ticks and to identify the genetic lineage of the circulating CCHFV strains. Therefore, a cross sectional field study on the distribution of Ixodidae ticks was carried out over three consecutive tick seasons (2012 - 2014); ticks were collected from small ruminants in 309 farms located in the mainland and five islands of Greece. In total, 2108 ticks were collected from sheep and goats. The identification of ticks to species level was carried out using taxonomic keys; two species of Rhipicephalus, two of Ixodes, five of Hyalomma, three of Haemaphysalis, and one of Dermacentor were identified. The species with the widest distribution were Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.) (64.8 %), R. bursa (25.9 %), and Dermacentor marginatus (4.1 %), whereas the least frequently collected species were Ixodes ricinus, I. gibbosus, Haemaphysalis parva, H. sulcata, H. punctata, Hyalomma marginatum, H. excavatum, H. dromedarii, H. rufipes, and H. impeltatum representing together less than 5.3 % of the collection. Grouping of ticks by collection date, location, animal host, tick species, and sex resulted in 1290 pools. Following tick homogenization and RNA extraction, an RT-nested PCR was applied for the detection of CCHFV. CCHFV was detected in 2.8% (36 of 1290) of the tick pools. Specifically, CCHFV was detected in 3.2% (27/843) of the R. sanguineus s.l. tick pools and in 2.4% (9 of 377) of the R. bursa tick pools. The regions with the highest CCHFV detection rate were Central and Western Macedonia (8.8%), Crete (6.2%) and Peloponnese (5.7%), while in Thessaly, Thrace and Epirus the percentage of positive pools were 3.1%, 1.4% and 1.2%, respectively. All H. marginatum ticks (the principal vector of CCHFV) were CCHFV negative. Phylogenetic analyses of the virus showed that sequences clustered into two genetic lineages, “Europe 1” (19/27) and “Europe 2” (8/27). Sequences of CCHFV lineage “Europe 1” were obtained mainly from R. sanguineus s.l. ticks (16/19), while sequences of lineage “Europe 2” were taken from R. bursa ticks (6/8). The sequences of the CCHFV lineage “Europe 2” of the present study differed from the prototype AP92 strain by 9.7% at nucleotide level. The present study gave a first insight into the tick fauna from mainland and islands in Greece. To date, there are no reports of CCHF cases in Greece (except the one in 2008 which was caused by a CCHFV strain belonging to the “Europe 1” lineage). The circulation of CCHFV strain(s) of lineage “Europe 2” in Greece, especially in regions where the seroprevalence is relatively high, together with the lack of human CCHF cases, suggests these strains are antigenic, with non- or low-pathogenic to humans. Further studies on these strains will increase our knowledge about the role of AP92-like strains in the CCHF epidemiology, which might be useful for drug and vaccine design. Regarding lineage “Europe 1”, it is probable that ticks of the Rhipicephalus genus are not competent virus vectors as are the ticks of Hyalomma genus. Further laboratory studies are needed to explore the role of Rhipicephalus spp. ticks in CCHFV maintenance and transmission.

Ο αιμορραγικός πυρετός Κριμαίας-Κογκό (Crimean - Congo Hemorrhagic Fever– CCHF), είναι σοβαρή οξεία εμπύρετη νόσος που συνοδεύεται συχνά από αιμορραγικές εκδηλώσεις και παρουσιάζει θνητότητα που κυμαίνεται από 5%-30%. Αιτιολογικός παράγοντας της νόσου είναι ο ιός του αιμορραγικού πυρετού Κριμαίας-Κογκό (CCHFV, genus Orthonairovirus, family Nairoaviridae). Η μετάδοση της νόσου στον άνθρωπο γίνεται με νύγμα κροτώνων, κυρίως του γένους Hyalomma, ή μετά από άμεση επαφή των βλεννογόνων ή του δέρματος με αίμα, εκκρίματα ή ιστούς μολυσμένων ζώων ή ανθρώπων. Η γεωγραφική διασπορά του CCHFV είναι η πιο εκτεταμένη από τους ιούς που μεταδίδονται με κρότωνες, καθ΄ όσον η παρουσία του αναφέρθηκε σε περισσότερες από 30 χώρες στην Αφρική, Ασία, Ν.Α Ευρώπη και στη Μέση Ανατολή. Η κατανομή του ιού ακολουθεί τη διασπορά των κροτώνων του γένους Hyalomma, οι οποίοι εξαπλώνονται έως το 50° βόρειο γεωγραφικό πλάτος. Τα στελέχη του CCHF διαχωρίζονται σε 9 γονότυπους: οι γονότυποι “Africa 1”, “Africa 2” , “Africa 3” και “Africa 4” περιλαμβάνουν στελέχη διαφόρων χωρών της Αφρικής, ο γονότυπος “Asia 1” με στελέχη της Μέσης Ανατολής, ο “Asia 2” με στελέχη από την Κίνα, το Τατζικιστάν, το Καζακστάν, το Ουζμπεκιστάν, ο “Europe 1” με στελέχη από τα Βαλκάνια, τη Ρωσία και την Τουρκία, ο “Europe 2” που περιλαμβάνει ένα μόνο στέλεχος, το ελληνικό στέλεχος AP92 και ο γονότυπος “Europe 3” με στελέχη από τη Ρωσία. Στην Ελλάδα ανιχνεύθηκαν στελέχη που ανήκουν στους γονοτύπους “Europe 1” και “Europe 2”, τα οποία διαφέρουν σημαντικά στο γονιδίωμα και στη λοιμογόνο δύναμή τους. Η μόνη (και θανατηφόρα) περίπτωση CCHF στην Ελλάδα παρατηρήθηκε τον Ιούνιο του 2008 και το στέλεχος ανήκε στον γονότυπο “Europe 1” ενώ το στέλεχος AP92 που ανήκει στον γονότυπο “Europe 2” απομονώθηκε το 1975 από κρότωνες Rhipicephalus bursa στην Βεργίνα της Κεντρικής Μακεδονίας. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η καταγραφή της διασποράς και συχνότητας των κροτώνων σε διάφορες περιοχές της Ελλάδας (ιδιαίτερα σε αυτές όπου είχαν πραγματοποιηθεί προηγουμένως οροεπιδημιολογικές μελέτες στον γενικό πληθυσμό), η χαρτογράφησή τους μέσω χρήσης συστημάτων γεωγραφικής και χωρικής ανάλυσης (GIS- SA), ο έλεγχος των κροτώνων για μόλυνση με τον CCHFV, καθώς και η γενετική και η φυλογενετική ανάλυση των στελεχών της μελέτης. Συγκεκριμένα, διεξήχθη μια εκτεταμένη μελέτη του πληθυσμού και της διασποράς των σκληρών κρότωνων (Ixodidae) σε τρεις διαδοχικές περιόδους (2012 - 2014) σε 309 κτηνοτροφικές μονάδες αιγών και προβάτων που βρίσκονται στην ηπειρωτική χώρα και σε πέντε νησιά της Ελλάδας. Συνολικά συλλέχθηκαν 2108 κρότωνες. Η ταυτοποίησή τους με ειδικές για αρθρόποδα διχοτομικές κλείδες ανέδειξε δύο είδη Rhipicephalus, δύο Ixodes, πέντε Hyalomma, τρία Haemaphysalis και ένα Dermacentor. Τα είδη με την ευρύτερη κατανομή ήταν τα Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.) (64,8%), R. bursa (25,9%) και Dermacentor marginatus (4,1%), και ακολουθούσαν τα Ixodes ricinus, Ι. gibbosus, Haemaphysalis parva, Η. sulcata, Η. punctata, Hyalomma marginatum, Η. excavatum, Η. dromedarii, Η. rufipes και Η. impeltatum που όλα μαζί αντιπροσωπεύουν περίπου το 5,3% της συλλογής. Οι κρότωνες διαχωρίστηκαν σε 1290 ομάδες ανάλογα με το είδος, το φύλο, το ξενιστή, την ημερομηνία και την περιοχή συλλογής τους. Μετά από ομογενοποίηση, απομονώθηκε το ιικό RNA και εφαρμόστηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-nested PCR) για την ανίχνευση του CCHFV. Ο ιός ανιχνεύθηκε σε 36 από τις 1290 (2,8%) ομάδες κροτώνων. Ειδικότερα, ανιχνεύθηκε σε 27 από τις 843 (3,2%) ομάδες κροτώνων του είδους R. sanguineus s.l. και σε 9 από τις 377 (2,4%) ομάδες του είδους R. bursa. Οι περιφέρειες με τα υψηλότερα ποσοστά ανίχνευσης του CCHFV ήταν η Κεντρική και Δυτική Μακεδονία (8,8%), η Κρήτη (6,2%) και η Πελοπόννησος (5,7%), ενώ στις Θεσσαλία, Θράκη και Ήπειρο τα ποσοστά ήταν 3,1%, 1,4% και 1,2% αντίστοιχα. Όλοι οι κρότωνες του είδους H. marginatum (που αποτελεί τον κύριο φορέα του CCHFV) ήταν αρνητικοί. Από την φυλογενετική ανάλυση των αλληλουχιών του ιού που ανιχνεύθηκαν σε 27 ομάδες κροτώνων φάνηκε η παρουσία των γονοτύπων “Europe 1” (19/27) και “Europe 2” (8/27). Ο γονότυπος “Europe 1” βρέθηκε κυρίως σε κρότωνες του είδους R. sanguineus s.l. (16/19), ενώ ο “Europe 2” σε κρότωνες του είδους R. bursa (6/8). Το γονιδίωμα του στελέχους CCHFV γονοτύπου “Europe 2” που ανιχνεύθηκε σε κρότωνες R. bursa διέφερε κατά 9,7% σε επίπεδο νουκλεοτιδίων από το πρότυπο στέλεχος AP92, το οποίο είχε απομονωθεί το 1975.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έδωσε μία πρώτη αποτύπωση σχετικά με τον πληθυσμό των κροτώνων στην ηπειρωτική χώρα και τα νησιά της Ελλάδας. Μέχρι σήμερα, δεν έχουν αναφερθεί κλινικές περιπτώσεις CCHF σε ανθρώπους (εκτός από μία περίπτωση το 2008 που οφειλόταν σε στέλεχος του γονοτύπου “Europe 1”). Η κυκλοφορία του CCHFV του γονοτύπου “Europe 2” σε περιοχές όπου ο οροεπιπολασμός είναι σχετικά υψηλός, σε συνδυασμό με την απουσία κλινικών περιστατικών, υποδηλώνει ότι αυτά τα στελέχη παρουσιάζουν αντιγονικότητα, αλλά έχουν μικρή η μηδαμινή λοιμογόνο δύναμη. Περαιτέρω μελέτες σε στελέχη του γονοτύπου “Europe 2” θα αυξήσουν τις γνώσεις μας σχετικά με το ρόλο αυτών των στελεχών τύπου ΑΡ92 στην επιδημιολογία του CCHF, οι οποίες θα μπορούσαν να είναι χρήσιμες για το σχεδιασμό φαρμάκων και εμβολίων. Όσον αφορά τον γονότυπο “Europe 1”, είναι πιθανό, οι κρότωνες του γένους Rhipicephalus να μην είναι ικανοί φορείς του ιού όπως είναι οι κρότωνες του γένους Hyalomma, οπότε θα απαιτηθούν περαιτέρω εργαστηριακές μελέτες για να διερευνηθεί ο ακριβής ρόλος τους στη συντήρηση και μετάδοση του CCHFV.