Οζώδης δερματίτιδα των βοοειδών: ανάπτυξη διαγνωστικών δοκιμών επιτήρησης σε εκτροφές που εφαρμόστηκε εμβολιασμός και διερεύνηση της παρεχόμενης παθητικής ανοσίας στους μόσχους

Abstract

Lumpy skin disease (LSD) is a transboundary viral disease of cattle with severe economic impact. Immunization of cattle with homologous live attenuated vaccines poses several diagnostic problems, as it has been associated with adverse reactions resembling disease symptoms. The latter hampers clinical diagnosis and poses challenges in virus identification. The aim of the present thesis was the development of diagnostic methods for surveillance in farms during vaccination campaigns and the study of the maternally derived immunity in calves. In the first part of the thesis the complete genome sequence of the first case of LSD in mainland Europe, was analyzed and studied. The research methodology consisted of NGS sequencing, comparative sequence analysis with other wild type (wt, epizootic) LSDV sequences and identification of target regions for designing primers and probes. Identified regions allocated throughout the LSDV genome resulted in a set of suitable genomic positions for new assay development depending on the diagnostic needs. Consequently, a duplex quantitative real-time PCR method targeting the GPCR gene was developed, for the concurrent detection and differentiation of wt and Neethling vaccine LSDV strains. The DIVA real-time PCR enables rapid and accurate differentiation of wt and Neethling vaccine LSDV in a single reaction, confirming diagnosis in suspect cases. In the framework of the present thesis, a second real-time PCR method was developed for the specific detection of wt LSDV utilizing b-actin gene as internal control. This new multiplex real time PCR method targeting the EEV gene was developed for the detection of wt LSDV in animals with adverse reactions to the vaccines and samples with potentially high viral load of the vaccine LSDV. The method is able to confirm diagnosis in suspect cases irrespective of the presence of the Neethling vaccine DNA and in this regard, it does not allow masking of the wt LSDV by the adverse reactions to the vaccine virus. The new real time PCR method is an important surveillance tool complementing the DIVA real time PCR during vaccination campaigns. In the last part of the thesis a study was conducted in order to access the titres and duration of maternally derived neutralizing antibodies against LSDV in calves born to immunized dairy cows. The study was conducted in a Greek farm of 200 Holstein cows which were immunized with a homologous Neethling strain based attenuated vaccine. Neutralizing antibody titres against LSDV were determined in colostrum samples as well as in calf sera obtained until day 150 after calving. A significant number of calves were not protected by maternal antibodies against the disease after the age of 3 months and likely even after the age of 2 months. The findings substantiate that the current recommendation for vaccination can be amended, to minimize the susceptible bovine population and enable optimized LSD prevention and eradication.

Η χρήση ζωντανών εμβολίων ελαττωμένης λοιμογόνου δύναμης με στέλεχος Neethling, για την ανοσοποίηση των βοοειδών έναντι του ιού της οζώδους δερματίτιδας των βοοειδών (Lumpy skin disease virus, LSDV), συσχετίζεται με την εμφάνιση σε ένα ποσοστό ζώων, μικρών δερματικών επιφανειακών οζιδίων, που προσoμοιάζουν με τα οζίδια του νοσήματος. Οι ανεπιθύμητες αντιδράσεις στο εμβόλιο επιβάλλουν τη διάκριση των επιζωοτικών (άγριων στελεχών του ιού που προκαλούν επιζωοτία) και εμβολιακών στελεχών του LSDV για την επιτήρηση σε εκτροφές που εφαρμόστηκε εμβολιασμός, ώστε να διασφαλίζεται η στοχευμένη θανάτωση των ζώων που νοσούν. Σκοπός της διατριβής ήταν η αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος του ελληνικού επιζωοτικού στελέχους LSDV, η ανάπτυξη νέων διαγνωστικών μεθόδων real-time PCR για την επιτήρηση σε εκτροφές που εφαρμόζεται εμβολιασμός και η διερεύνηση της παρεχόμενης παθητικής ανοσίας στους μόσχους. Αλληλουχήθηκε το επιζωοτικό LSDV στέλεχος Evros/GR/15 σε ολόκληρο το γονιδίωμα και ταυτοποιήθηκαν οι διαφορές με την αλληλουχία αναφοράς και με άλλα επιζωοτικά LSDV στελέχη. Τέλος, αναγνωρίστηκαν οι κατάλληλες περιοχές του γονιδιώματος του Evros/GR/15 που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον σχεδιασμό real-time PCR μεθόδων. Στη συνέχεια έγινε ανάπτυξη και επικύρωση μιας νέας διαγνωστικής μεθόδου DIVA real-time PCR για τη διάκριση των επιζωοτικών και εμβολιακών στελεχών του LSDV. Η νέα μέθοδος σχεδιάστηκε στοχεύοντας το γονίδιο GPCR και αξιολογήθηκε ως πολύ ειδική και ευαίσθητη μοριακή μέθοδος. Η DIVA real-time PCR είναι μέθοδος εκλογής για την επιτήρηση σε εκτροφές που εφαρμόζεται εμβολιασμός και η εφαρμογή της δίνει τη δυνατότητα της γρήγορης διαφορικής διάγνωσης ανάμεσα στα περιστατικά της νόσου και στα περιστατικά αντιδράσεων στα εμβόλια. Περαιτέρω, στα πλαίσια της διατριβής πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη μιας δεύτερης διαγνωστικής μεθόδου real-time PCR για την ανίχνευση των επιζωοτικών στελεχών του LSDV στοχεύοντας το γονίδιο EEV του LSDV, με την ταυτόχρονη ανίχνευση ενδογενούς μάρτυρα β-ακτίνης. Σε ζώα με αντίδραση στο εμβόλιο, όπου εντοπίζονται υψηλοί τίτλοι του εμβολιακού LSDV στελέχους, η μέθοδος παρέχει τη δυνατότητα ανίχνευσης πολύ μικρών συγκεντρώσεων του επιζωοτικού LSDV, καθιστώντας δυνατό τον έλεγχο της αφανούς κυκλοφορίας του επιζωοτικού LSDV που θα μπορούσε εν δυνάμει να καλυφθεί κατά τους εμβολιασμούς. Τέλος, για πρώτη φορά εκτιμήθηκε ο τίτλος και η διάρκεια των μητρικών εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι του εμβολιακού Neethling LSDV στελέχους, σε μόσχους εμβολιασμένων αγελάδων ελληνικής εκτροφής. Διαπιστώθηκε ότι, ο μεγαλύτερος αριθμός των μόσχων δεν προστατεύεται από τη μητρική ανοσία μέσω του πρωτογάλακτος μετά τον 3ο μήνα και πιθανόν και μετά το 2ο μήνα της ζωής τους, καθώς μόνο σε μόσχους με υψηλούς τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων την 3η ημέρα της ζωής τους, η μητρική ανοσία διήρκεσε μέχρι την 90η ημέρα. Από τα ευρήματα αυτά προκύπτει ότι οι ισχύουσες κατευθυντήριες οδηγίες για την ηλικία έναρξης των εμβολιασμών κατά της οζώδους δερματίτιδας των βοοειδών θα πρέπει να αναθεωρηθούν, ώστε να μειωθεί ο πληθυσμός των ευπαθών στη μόλυνση βοοειδών και να διασφαλιστεί η αποτελεσματικότητα των μέτρων ελέγχου της νόσου στην Ελλάδα και την Ευρώπη.