Φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική μελέτη του αντικαρκινικού συνθετικού πεπτιδίου PCK3145 και PEG-PCK3145 σε ζώα

Abstract

Protein PSP94 (also known as β-micrososinoprotein, with a molecular weight of 14 kDa) plays an inhibitory role in carcinogenesis, induces tumor cell apoptosis and reduces tumor growth both in vitro and in vivo (Garde et al., 1999; Shukeir et al., 1999; al., 2003). Research groups have attempted to study the action of PSP94 and elucidate the pharmacophore sequence that has this specific protective anti-cancer activity. After studying 12 amino acid sequences of PSP94, it was found that the 15-peptide from the 31st to the 45th amino acid, with code named PCK3145, has the best anti-antiogenetic and anti-metastatic activity in in vitro and in vivo cancer models (Shukeir et al., 2004). The mechanism of action of PCK3145 is not fully known but has been found to inhibit the secretion of metalloproteinase-9 (MMP-9) through rapid phosphorylation of ERK kinase as well as its subsequent binding to the cell surface leading to anti-metastatic activity (Annabi, Bouzeghrane, et al., 2006). It also inhibits the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling through ERK phosphorylation, which reflects its anti-antiogenetic activity (Lamy et al., 2006).However, the low in vivo stability of PCK3145 as well as its rapid rate of clearance severely limit its clinical use in humans (Hawkins et al., 2005).The present doctoral thesis aims to investigate the pharmacokinetic and pharmacodynamic profile of PCK3145 by conjugating with polyethylene glycol 20 (PEG 20). Biochemical modification of molecules with polyethylene glycol is known to alter pharmacokinetics, prolonging the half-life and delaying the clearance of many biologically active compounds (Harris, Martin and Modi, 2001; Haubner et al., 2001; Dennis et al., 2002). LC-MS / MS, UHPLC-UV and ELISA analytical methods were developed and validated to quantify PCK3145 and PEG-PCK3145 in mouse plasma. Specifically, the LC-MS / MS method was used to determine the parent PCK3145 with a linearity range of 0.125 to 4.0 µg/mL and accuracy and precision within the acceptable range (15% of the actual value for the quality control samples and 20 % for the lowest concentration level). The UHPLC-UV method with a calibration curve range of 0.05 to 2.0 mg/mL with excellent accuracy and precision within the acceptable range (15% of the actual value for the quality control samples) was used to determine PEG-PCK3145 in mouse plasma. Additionally, for the determination of PCK3145 after conjugation with polyethylene glycol, the pegylated peptide calibration curve from 1.76 to 56.3 ng / mL was applied.The above methods were successfully employed to study the stability of peptides in mice plasma under different storage conditions. The findings of the stability study indicate that after one week of storage at 4-8 °C, three repeated freeze-thaw cycles and storage for 6 months at -20 ° C remained stable. In addition, the proteolytic stability of the peptides in whole blood and mouse plasma was studied and as a result they remain intact after 24 hours of incubation at 37 °C (95% of PCK3145 and 92% of PEG). The pharmacokinetic profile of PCK3145 was studied before and after conjugating to polyethylene glycol 20, in two groups of twelve male SCID mice, after administration of 100 µg/kg PCK3145 and 1000 µg/kg PEG-PCK3145 (equal to 75 µg/kg PCK3145) intraperitoneally. The results of the pharmacokinetic study show that the half-life before and after pegylation was 9.25 and 11.55 minutes (p=0.074), the clearance was 0.088 and 0.023 mL/min (p=0.081) and the volume of distribution was 1.17 and 0.37 mL (p=0.067), respectively.Finally, the in vivo antitumor activity of PEG-PCK3145 was investigated following intraperitoneal administration to SCID mice with prostate tumor xenograft. The reduction of tumor size in SCID mice was measured after administration of 1000 µg/kg and 100 µg/kg PEG-PCK3145, 100 µg/kg PCK3145, 1000 µg/kg PEG20 (negative control) and 10 mg/kg docetaxel (positive control), once daily for 6 weeks. All the regimens showed a statistically significant decrease in tumor size compared to the negative control PEG20 (p<0.05). PEG-PCK3145 at a dose of 1000 µg/kg (corresponding to 75 µg/kg PCK3145) showed the same effect in terms of tumor reduction compared to 100 µg/kg of PCK3145. A clear dose-dependent response was observed for the PEG-PCK3145 as the lower dose of 100 µg/kg of PEG-PCK3145 (corresponding to 7.5 µg/kg PCK3145) was found to be less effective than the 1000 µg/kg of PEG-PCK3145 (p <0.05).In summary, the pegylation of PCK3145 gave a biologically active molecule, stable in storage conditions, as well as in enzymatic cleavage in whole blood and mouse plasma. PEG-PCK3145 has been shown to have an increased half-life and an apparent volume of distribution, with a reduced rate of clearance in mice relative to the parent peptide, but no statistical different in the pharmacokinetic parameters. In prostate tumor xenograft model, PEG-PCK3145 was found to be slightly more potent than the parent PCK3145 compared to equimolary. It would be of particular interest for future clinical use to optimize the pharmacokinetic parameters of the new anti-cancer synthetic peptide PCK3145, possibly by glycosylation or cyclization or the use of nanoparticles / liposomes.

Η πρωτεΐνη PSP94 (γνωστή και ως β-μικροσεμινοπρωτεϊνη, με μοριακό βάρος 14kDa) παίζει ανασταλτικό ρόλο στη καρκινογένεση, επάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και μειώνει την ανάπτυξη νεοπλασιών τόσο in vitro όσο και in vivo (Garde et al., 1999, Shukeir et al., 2003). Eρευνητικές ομάδες προσπάθησαν να μελετήσουν διεξοδικά τη δράση της πρωτεΐνης PSP94 και να αποσαφηνίσουν τη φαρμακοφόρο αλληλουχία που έχει την συγκεκριμένη προστατευτική αντικαρκινική δράση. Μετά τη μελέτη 12 αμινοξικών αλληλουχιών της PSP94, βρέθηκε ότι το 15-πεπτίδιο από το 31ο έως το 45ο αμινοξύ, με τη κωδική ονομασία PCK3145, έχει την καλύτερη αντι-αγγειογενετική και αντι-μεταστατική δράση σε in vitro και in vivo καρκινικά μοντέλα (Shukeir et al., 2004). Ο μηχανισμός δράσης του PCK3145 δεν είναι πλήρως γνωστός ωστόσο έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την έκκριση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9), μέσω ταχείας φωσφορυλίωσης της κινάσης ERK, όσο και την επακόλουθη πρόσδεση της στην κυτταρική επιφάνεια οδηγώντας σε αντι-μεταστατική δράση (Annabi, Bouzeghrane, et al., 2006). Επιπλέον αναστέλλει την έκφραση της σηματοδότησης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) μέσω της φωσφορυλίωσης ERK γεγονός που αντικατοπτρίζει την αντι-αγγειογενετική δράση του (Lamy et al., 2006). Εν τούτοις, η χαμηλή in vivo σταθερότητα του πεπτιδίου PCK3145 καθώς και ο γρήγορος ρυθμός κάθαρσής του, περιορίζουν σημαντικά τη κλινική χρήση στον άνθρωπο (Hawkins et al., 2005). Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στη διερεύνηση του φαρμακοκινητικού και φαρμακοδυναμικού προφίλ του PCK3145 κατόπιν σύζευξης με πολυαιθυλενογλυκόλη 20 (PEG 20). Η βιοχημική τροποποίηση μορίων με πολυαιθυλενογλυκόλη είναι γνωστό ότι αλλάζει τη φαρμακοκινητική, επιμηκύνοντας τον χρόνο ημιζωής και επιβραδύνοντας την κάθαρση πολλών βιολογικά δραστικών ενώσεων (Harris, Martin and Modi, 2001; Haubner et al., 2001; Dennis et al., 2002). Αρχικά αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν αναλυτικές μέθοδοι LC-MS/MS,UHPLC-UV και ELISA, με στόχο τον ποσοτικό και ποιοτικό προσδιορισμό των πεπτιδίων PCK3145 και PEG-PCK3145 σε πλάσμα μυών. Συγκεκριμένα, η αναλυτική μέθοδος LC-MS/MS χρησιμοποιήθηκε για προσδιορισμό του μητρικού πεπτιδίου PCK3145 με εύρος γραμμικότητας από 0.125 έως 4.0 μg/mL και ακρίβεια και πιστότητα εντός της αποδεκτής περιοχής (15% από την πραγματική τιμή για τα δείγματα ποιοτικού ελέγχου και το 20% για το κατώτατο επίπεδο συγκέντρωσης). Για τον προσδιορισμό του PEG-PCK3145 σε πλάσμα μυός χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος UHPLC-UV με εύρος της καμπύλης βαθμονόμησης από 0.05 έως 2.0 mg/mL και εξαιρετική ακρίβεια και πιστότητα εντός της αποδεκτής περιοχής (15% από την πραγματική τιμή για τα δείγματα ποιοτικού ελέγχου και 20% για το κατώτατο επίπεδο συγκέντρωσης). Επιπροσθέτως, για τον προσδιορισμό του PCK3145 μετά τη σύζευξη με πολυαιθυλενογλυκόλη χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ELISA με καμπύλη βαθμονόμησης του πεγκυλιωμένου πεπτιδίου από 1.76 έως 56.3 ng/mL.Με τη βοήθεια των παραπάνω μεθόδων ελέγχθηκε η σταθερότητα των πεπτιδίων σε πλάσμα μυός κάτω από διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης. Τα ευρήματα της μελέτης σταθερότητας φανερώνουν ότι μετά από μια εβδομάδα παραμονής των δειγμάτων στους 4-8 °C, τρείς επαναλαμβανόμενους κύκλους ψύξης-απόψυξης και αποθήκευσή τους για 6 μήνες στους -20 °C παρέμειναν σταθερά. Επιπλέον, μελετήθηκε η πρωτεολυτική σταθερότητα των πεπτιδίων σε πλήρες αίμα και πλάσμα μυός, με αποτέλεσμα να παραμένουν άθικτα μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 °C (95% για το PCK3145 και 92% για το PEG-PCK3145). Στη συνέχεια μελετήθηκε το φαρμακοκινητικό προφιλ του PCK3145 πριν και κατόπιν σύζευξης με πολυαιθυλενογλυκόλη 20, σε δύο ομάδες των δώδεκα αρσενικών SCID μυών, μετά από ενδοπεριταναϊκή χορήγηση 100 μg/kg PCK3145 και 1000 μg/kg PEG-PCK3145 (αντιστοιχεί σε 75 μg/kg PCK3145). Τα αποτελέσματα της φαρμακοκινητικής μελέτης αποδεικνύουν ότι ότι ο χρόνος ημιζωής πρίν την πεγκυλίωση και μετά την πεγκυλίωση βρέθηκε 9.25 και 11.55 minutes (p=0.074), η κάθαρση ήταν 0.088 και 0.023 mL/min (p=0.081) και ο όγκος κατανομής ήταν 1.17 και 0.37 mL (p=0.067), αντίστοιχα. Τέλος, διερευνήθηκε η in vivo αντικαρκινική δράση του πεγκυλιωμένου πεπτιδίου PEG-PCK3145 μετά την ενδοπεριταναϊκή χορήγησή του σε SCID μύες που έφεραν εμφύτευμα καρκινικών κυττάρων προστάτου (PC3). Μετρήθηκε η μείωση του μεγέθους του όγκου στους SCID μύες, μετα από χορήγηση 1000 μg/kg και 100 μg/kg PEG-PCK3145, 100 μg/kg PCK3145, 1000 μg/kg PEG20 (αρνητικός μάρτυρας) και 10 mg/kg δοσεταξέλης (θετικός μάρτυρας), μια φορά ημερησίως για 6 εβδομάδες. Όλα τα σχήματα έδειξαν στατιστικά σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα PEG20 (p<0.05). Το PEG-PCK3145 σε δόση 1000 μg/kg (το οποίο αντιστοιχεί σε 75 μg/kg PCK3145) έδειξε την ίδια δράση αναφορικά με τη μείωση του όγκου συγκρινόμενη με τη δόση των 100 μg/kg PCK3145. Μία σαφής δόσο-εξαρτώμενη απόκριση παρατηρήθηκε για το πεγκυλιωμένο πεπτίδιο PEG-PCK3145 καθώς η χαμηλότερη δόση του PEG-PCK3145 των 100 μg/kg, (τα οποία αντιστοιχούν σε 7.5 μg/kg PCK3145) βρέθηκαν λιγότερο αποτελεσματικά από τη δόση των 1000 μg/kg του PEG-PCK3145 (p<0.05). Συνοψίζοντας, η πεγκυλίωσή του PCK3145 έδωσε ένα βιολογικά ενεργό μόριο, σταθερό σε συνθήκες αποθήκευσης, καθώς και στην ενζυματική διάσπαση σε ολικό αίμα και πλάσμα μυών. Το PEG-PCK3145 έδειξε να έχει αυξημένο μεν χρόνο ημιζωής και φαινόμενο όγκο κατανομής, μειωμένο δε ρυθμό κάθαρσης σε μύες σε σχέση με το μητρικό πεπτίδιο, χωρίς όμως στατιστική σημαντικότητα στις διαφορές των φαρμακινητικών παραμέτρων. Σε μύες που έφεραν εμφύτευμα όγκου, το PEG-PCK3145 βρέθηκε ελαφρά δραστικότερο από το μητρικό PCK3145 συγκρινόμενο ισομοριακά. Θα είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη μελλοντική κλινική χρήση, να βελτιστοποιηθούν οι φαρμακοκινητικές παράμετροι του νέου αντικαρκινικού συνθετικού πεπτιδίου PCK3145, πιθανώς με γλυκοζυλίωση ή κυκλοποίηση ή χρήση νανοσωμάτων/λιποσωμάτων.