Διερεύνηση του μηχανισμού δράσης φυσικού και εδώδιμου προϊόντος στην παθοφυσιολογία του καρκίνου του προστάτη: μελέτη μονοχορήγησης και συγχορήγησης με χημειοθεραπευτικό φάρμακο

Abstract

Introduction: Prostate cancer (PCa) is the second most common cancer and the sixth most common cause of death from cancer in men, being a major public health concern. Adriamycin (ADR) is an anthracycline widely used as a chemotherapeutical agent against a variety of cancers, including prostate cancer. However, Adriamycin causes severe cardiotoxic and nephrotoxic side effects to the patients, shown even after decades. Hence, there is an urgent need to discover new supplementary treatments in order to reduce ADR cytotoxicity in normal cells without affecting and even enhancing its antitumor potential. Over the last years, several natural dietary compounds have been tested for their anticancer activity, either alone or in combination with chemotherapeutical agents. Goal: Two natural extracts, SEE (Silymarin Enriched Extract) and GGE (Glycyrrhiza Glabra Extract), were isolated from the plant Silybum marianum (Asteraceae) and the plant Glycyrrhiza glabra (Fabaceae), respectively, in order to evaluate their effect on the proliferation of androgen-independent prostate cancer cells (PC-3), when they are administrated alone or in combination with Adriamycin. In addition, some aspects of the implicated mechanism of action of the two extracts were investigated, focusing on autophagy. Autophagy is an endogenous mechanism of cells delivering their own cytoplasmic materials and organelles to lysosomes for degradation and the role of autophagy in growth progression or prevention of cancer cells still remains controversial. Methodology: PC-3 cells were treated with SEE or GGE alone, with silibinin or silycristine (major bioactive compounds of SEE extract) alone and in combination with Adriamycin (ADR) and cell proliferation inhibition was evaluated by the MTT assay. Cell cycle alterations, apoptosis and autophagy rates were measured through flow cytometry while expression levels of autophagy related genes and proteins were evaluated by Real Time PCR, specific ELISA kits and western blotting. TEM (Transmission Electron Microscopy) was used to reveal ultrastructural features of autophagy while NMR spectrometry was used in order to determine the metabolic profile of cells after each treatment. Results: Treatment of PC3 cells with ADR, SEE, silibin and silychristine inhibited cell proliferation in a dose-dependent manner, with silibinin being more bioactive than silychristine. Moreover, silibin antiproliferative effect is comparable to SEE, suggesting that the overall effect of SEE extract is mainly attributed to silibin. Furthermore, SEE extract and its bioactive compounds exert an additive effect when combined with ADR, reducing the pharmacologically efficient dosage of ADR. In particular, the combinational scheme of ADR+SEE enhances the ADR induced protective autophagy in its initiative steps, yet it finally suppresses the autophagolysosome degradation, leading to an excessive cell death through the induction of apoptosis. GGE alone also has antiproliferative properties against PC-3 cells. GGE in co-treatment with ADR shows and additive effect, also reducing the pharmacologically efficient dosage of ADR. ADR+GGE co-treatment enhances both the autophagic and apoptotic machinery of PC-3 cells, leading to excessive cell death. In conclusion, both natural extracts tested (SEE and GGE) highly sensitize ADR-mediated cytotoxicity in PC-3 cells, suggesting the possibility of decreasing the ADR dosage, in order to reduce the side effects without reducing the pharmacological potential.

Εισαγωγή: O καρκίνος του προστάτη αποτελεί τον δεύτερο πιο συχνό καρκίνο και την έκτη πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες. Η αδριαμυκίνη χρησιμοποιείται ευρέως ως χημειοθεραπευτικό φάρμακο σε μια πληθώρα νεοπλασιών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, όμως προκαλεί πολλές παρενέργειες στους ασθενείς οι οποίες εκδηλώνονται ακόμα και μετά από δεκαετίες. Για το λόγο αυτό, αποτελεί επιτακτική ανάγκη, η ανάδειξη μορίων τα οποία θα μειώνουν την τοξικότητα της αδριαμυκίνης στα φυσιολογικά κύτταρα χωρίς να επηρεάζουν τη δράση της έναντι των καρκινικών κυττάρων, και αν είναι δυνατό, ακόμα και να την ενισχύουν. Τις τελευταίες δεκαετίες, μια πληθώρα φυσικών προϊόντων έχουν μελετηθεί για την πιθανή αντικαρκινική τους δράση, όταν χορηγούνται είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Σκοπός: Στην παρούσα μελέτη παρασκευάστηκαν δύο φυτικά προϊόντα, το SEE (Silymarin Enriched Extract = Εμπλουτισμένο Εκχύλισμα Σιλυμαρίνης) και το GGE (Glycyrrhiza Glabra Extract = Εμπλουτισμένο Κλάσμα σε Γκλαμπριδίνη από το φυτό Glycyrrhiza Glabra), από τα φυτά Silybum marianum (Asteraceae) και Glycyrrhiza glabra (Fabaceae) αντίστοιχα, με απώτερο στόχο να μελετηθεί η επίδρασή τους στον πολλαπλασιασμό των ανδρογονο-ανεξάρτητων καρκινικών προστατικών κυττάρων (PC-3), όταν χορηγούνται μόνα τους ή σε συνδυασμό με την αδριαμυκίνη. Παράλληλα, μελετήθηκαν κάποιες παράμετροι του μηχανισμού δράσης των δύο εκχυλισμάτων, δίνοντας έμφαση στη μελέτη του μηχανισμού της αυτοφαγίας. Η αυτοφαγία αποτελεί έναν ενδογενή μηχανισμό αποδόμησης συστατικών του κυττάρου μέσω των λυσοσωμάτων, ενώ μέχρι σήμερα ο ρόλος της αυτοφαγίας στην εξέλιξη ή αναστολή του καρκίνου παραμένει διφορούμενος. Μεθοδολογία: Πραγματοποιήθηκε επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων SEE και GGE, καθώς και των καθαρών ουσιών σιλίμπινη και σιλικριστίνη (δραστικές ουσίες του εκχυλίσματος SEE), είτε ως μονοχορήγηση είτε ως συγχορήγηση με την αδριαμυκίνη και εκτιμήθηκε η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω της δοκιμασίας ΜΤΤ. Ακολούθως, μελετήθηκαν μέσω κυτταρομετρίας ροής, πιθανές μεταβολές στον κυτταρικό κύκλο, στην απόπτωση και στην αυτοφαγία, ενώ παράλληλα αξιολογήθηκε η έκφραση γονιδίων και πρωτεϊνών – δεικτών της αυτοφαγίας, μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου και μεθόδων ανοσοαποτύπωσης. Με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης αποτυπώθηκαν αυτοφαγικές δομές, ενώ παράλληλα με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR εκτιμήθηκαν αλλαγές στο μεταβολικό προφίλ των κυττάρων.Αποτελέσματα: Η μονοχορήγηση με αδριαμυκίνη, SEE, σιλιμπινίνη ή σιλυκριστίνη αναστέλλει δοσο-εξαρτώμενα τον πολλαπλασιασμό των PC-3 κυττάρων. Ειδικότερα, η σιλιμπινίνη είναι πιο δραστική από την σιλυκριστίνη, ενώ παράλληλα η κυτταροστατική της δράση είναι ανάλογη του ολικού εκχυλίσματος SEE, υποδηλώνοντας ότι η δράση του SEE οφείλεται κυρίως στην σιλιμπινίνη. Επιπλέον, οι συγχορηγήσεις αδριαμυκίνης-SEE, αδριαμυκίνης-σιλιμπινίνης και αδριαμυκίνης-σιλυκριστίνης παρουσιάζουν αθροιστική κυτταροστατική δράση έναντι των PC-3 κυττάρων, μειώνοντας σημαντικά την απαιτούμενη δραστική συγκέντρωση της αδριαμυκίνης. Ειδικότερα, η συγχορήγηση Αδριαμυκίνης-SEE, σε ένα πρώτο χρόνο ενισχύει την επαγώμενη από την Αδριαμυκίνη προστατευτική αυτοφαγία των κυττάρων, στην συνέχεια όμως προκαλεί αναστολή της λύσης των αυτοφαγο-λυσοσωμάτων, οδηγώντας τελικά τα κύτταρα σε θάνατο μέσω του μηχανισμού της απόπτωσης. Αντίστοιχα, το εκχύλισμα GGE αναστέλλει δοσοεξαρτώμενα τον πολλαπλασιασμό των PC-3 κυττάρων ενώ η συγχορήγηση αδριαμυκίνης-GGE παρουσιάζει σημαντική αθροιστική δράση, μειώνοντας επίσης την απαιτούμενη δραστική συγκέντρωση της αδριαμυκίνης. Η συγχορήγηση αδριαμυκίνης-GGE ενισχύει σημαντικά τόσο την αυτοφαγία όσο και την απόπτωση των κυττάρων οδηγώντας σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο. Καταλήγοντας, και τα δύο εκχυλίσματα που δοκιμάστηκαν στην παρούσα μελέτη, ενισχύουν σημαντικά την επίδραση της αδριαμυκίνης έναντι των PC-3 κυττάρων, προσβλέποντας πιθανώς μελλοντικά στη χορήγηση μικρότερης δόσης Αδριαμυκίνης στους ασθενείς, ώστε να περιοριστούν οι παρενέργειες διατηρώντας όμως την επιθυμητή φαρμακολογική δράση.