Molecular genetic and functional investigation of microbial arylamine N-acetyltransferases

Abstract

Every living organism comes into contact with, and may internalize, various xenobiotics from the environment on a constant basis. In order to adapt to the chemical stress caused by potentially harmful exogenous compounds, all organisms have developed effective metabolic systems for the biotransformation and elimination of xenobiotics, avoiding exposure to toxic concentrations. One of the pathways involved in the detoxification of xenobiotics employs arylamine N-acetyltransferase (NAT) enzymes, catalyzing the N-acetylation of aromatic amines and hydrazines. The overall aim of this project was to characterize NAT genes and study the xenobiotic metabolizing capabilities of their enzyme products in microorganisms, mainly bacteria.For that purpose, a collection of 93 bacterial isolates from various natural or polluted (mainly aquatic) environments was compiled to be studied, based on in silico survey of genomic databases along with other criteria. The collection included taxa with potentially interesting xenobiotic biodegradation properties and/or rich secondary metabolism. Molecular phylogenetic taxonomic characterization was performed for the available isolates, based on 16S rRNA gene sequencing. A subset of 60 representative isolates was then assessed for tolerance of 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA), identifying species that could be useful for bioremediation of this recalcitrant environmental pollutant, a common byproduct of industrial manufacturing and agrochemical usage.The study was then focused on the comparative functional investigation of sixteen NAT genes and their protein products, amplified and cloned from bacterial isolates of the above collection. Affinity chromatography purified recombinant NAT proteins generated from those clones were used in enzymatic activity assays to determine selectivity for both donor and acceptor substrates. Thermal stability assays were additionally performed by differential scanning fluorimetry, to assess recombinant NAT proteins individually and in the presence of four different donor substrates. The majority of studied NAT enzymes were selective for acetyl-CoA and propionyl-CoA as donor substrates, generating lower specific activity with the second compound. The screens for acyl-group acceptor substrates demonstrated high activity levels with hydralazine (HDZ), 2-aminophenol (2AP) and 5-aminosalicylic acid (5AS). Those findings are consistent with earlier reports in the literature. Five of the tested homologs did not show any specific preference for any of the four acyl-CoA compounds tested, providing only marginal activity with various combinations of assayed acyl-group donor and acceptor substrates. Those homologs mostly belong to microorganisms bearing more than one NAT paralog in their genome, suggesting that these could be functionally redundant or may have diverged to catalyze different reactions.Notable deviations from this pattern were observed for (STRVZ)NAT2 (belonging to the soil streptomycete Streptomyces zaomyceticus), which appeared more selective for 2AP, p-anisidine (ANS) and 3,4-DCA, as acceptor substrates, as well as for the recombinant (TSUPD)NAT1 enzyme from corynebacterium Tsukamurella paurometabola, that provided the highest specific activity with malonyl-CoA and 5AS, while also maintaining activity in the presence of acetyl-, propionyl- and succinyl-CoA but at lower levels. This homolog was further studied by kinetic analysis for its preferred acyl-group donor and acceptor substrates. Furthermore, in silico investigation of (TSUPD)NAT1 by sequence alignment and structural modeling against other known NAT proteins revealed an atypical catalytic triad consisting of residues Cys, His and Glu, instead of the Cys, His and Asp that are characteristic of this enzyme family.The study was further expanded to explore additional methodologies for the investigation of microbial NAT genes and their protein products, with regard to their endogenous role within cells. The approaches implemented included a series of cell lysis methods followed by quality assessment of produced lysates, enzymatic activity assays using Ehrlich's reagent to try to detect endogenous NAT activity, as well as the design and attempt of protocols for RNA isolation, cDNA synthesis and RT-PCR, aiming to detect and measure NAT gene expression. Although incomplete, these initial attempts open the way for future research into the endogenous role of bacterial NAT homologs and the factors affecting their in vivo expression and enzymatic activity.Finally, as a contribution to parallel investigations of the group into the structure and function of fungal NAT proteins, six NAT homologs from the phytopathogenic ascomycetes Fusarium verticillioides and Fusarium graminearum were expressed in recombinant form, under conditions enabling the incorporation of modified amino acid L-selenomethionine (Se-Met) into the polypeptide chain, for future application in protein crystallography. Additionally, a kinetic analysis of recombinant (GIBM7)NAT3 isoenzyme of F. verticillioides was performed, using acetyl-CoA as its preferred acyl-group donor substrate.This study initiated a new line of investigation in the field, paving the way for comparative molecular genetic and functional investigations of NAT genes in bacteria representative of a broad taxonomic range. It explored bacterial xenobiotic metabolism, focusing on NAT enzymatic function and demonstrating considerable divergence among different homologs. This original work also generated important research material (e.g. gene constructs) that will support future studies.

Όλοι οι ζώντες οργανισμοί έρχονται διαρκώς σε επαφή με διάφορες ξενοβιοτικές ουσίες του περιβάλλοντός τους. Προκειμένου να προστατευθούν από επιβλαβή έκθεση σε τοξικές συγκεντρώσεις, οι οργανισμοί έχουν αναπτύξει προσαρμοστικούς μηχανισμούς και μεταβολικά μονοπάτια που επιτρέπουν τη βιομετατροπή και εξάλειψη εξωγενών ουσιών. Ένα τέτοιο μονοπάτι περιλαμβάνει τα ένζυμα της οικογένειας των Ν-ακετυλοτρανσφερασών των αρυλαμινών (ΝΑΤ), τα οποία καταλύουν τη Ν-ακετυλίωση αρωματικών αμινών και υδραζινών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο χαρακτηρισμός γονιδίων ΝΑΤ σε μικροοργανισμούς, κυρίως βακτήρια, και η μελέτη των αντίστοιχων ενζύμων ως προς την ικανότητά τους να μεταβολίζουν ξενοβιοτικές ουσίες.Για τους σκοπούς της παρούσας διατριβής, επιλέχθηκε προς μελέτη μία συλλογή ενενήντα τριών βακτηριακών στελεχών, απομονωμένων από διάφορα φυσικά ή επιβαρυμένα με ρύπους (κυρίως υδάτινα) περιβάλλοντα. Η επιλογή αυτή βασίστηκε σε συγκεκριμένα κριτήρια, μετά και από υπολογιστική αναζήτηση μικροβιακών γονιδίων ΝΑΤ σε γονιδιωματικές βάσεις δεδομένων. Η συλλογή περιλάμβανε ταξινομικές ομάδες βακτηρίων που είτε παρουσιάζουν ενδιαφέρον ως προς την ικανότητά τους να βιοαποικοδομούν ξενοβιοτικές ουσίες, είτε διαθέτουν πλούσιο δευτερογενή μεταβολισμό. Η μοριακή ταξινόμηση των στελεχών πραγματοποιήθηκε με αλληλούχηση των γονιδίων 16S rRNA. Στη συνέχεια, ένα υποσύνολο 60 αντιπροσωπευτικών στελεχών μελετήθηκε για αντοχή στην 3,4-διχλωροανιλίνη (3,4-DCA), προσδιορίζοντας έτσι βακτηριακά είδη με δυνητική χρησιμότητα στη βιοαποκατάσταση του συγκεκριμένου βλαπτικού περιβαλλοντικού ρύπου που αποτελεί σύνηθες παραπροϊόν των βιομηχανικών δραστηριοτήτων και της χρήσης αγροχημικών σκευασμάτων.Η μελέτη ακολούθως εστίασε στη συγκριτική λειτουργική διερεύνηση 16 γονιδίων ΝΑΤ, τα οποία ενισχύθηκαν και κλωνοποιήθηκαν από στελέχη της παραπάνω συλλογής. Μετά από έκφραση και καθαρισμό (μέσω χρωματογραφίας συγγένειας) των αντίστοιχων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνικών προϊόντων, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές ενζυμικής ενεργότητας για προσδιορισμό της επιλεκτικότητας υποστρώματος δότη και δέκτη ακυλομάδας, δηλαδή για τα δύο διαδοχικά σκέλη της ενζυμικής αντίδρασης. Επιπλέον, εφαρμόστηκε η τεχνική της διαφορικής φθορισμομετρικής σάρωσης για εκτίμηση της θερμικής σταθερότητας των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ΝΑΤ, τόσο απουσία, όσο και παρουσία διαφορετικού κάθε φορά υποστρώματος-δότη ακυλομάδας. Η πλειοψηφία των ενζύμων ΝΑΤ που μελετήθηκαν έδειξε προτίμηση κυρίως για το ακέτυλο συνένζυμο Α (acetyl-CoA) και δευτερευόντως για το προπιόνυλο συνένζυμο Α (propionyl-CoA), σε συμφωνία με την πρότερη βιβλιογραφία. Oι χημικές ουσίες που παρήγαγαν υψηλότερη ενζυμική ενεργότητα ως δέκτες ακυλομάδας ήταν οι υδραλαζίνη (HDZ), 2-αμινοφαινόλη (2AP) και 5-αμινοσαλικυλικό οξύ (5AS). Πέντε από τα ομόλογα ένζυμα ΝΑΤ που μελετήθηκαν παρείχαν, ωστόσο, μόλις οριακά ανιχνεύσιμη ειδική ενεργότητα με όλους τους συνδυασμούς υποστρωμάτων που δοκιμάστηκαν. Τα συγκεκριμένα ομόλογα ανήκουν κυρίως σε βακτήρια που φέρουν περισσότερα από ένα γονίδια NAT, επομένως αυτά θα μπορούσαν είτε να είναι ανενεργά ως πλεονάζοντα, είτε να έχουν παρεκκλίνει λειτουργικά ώστε να καταλύουν διαφορετικές αντιδράσεις.Σημαντικές διαφοροποιήσεις ως προς την προτίμηση υποστρωμάτων παρατηρήθηκαν για δύο ομόλογα ένζυμα ΝΑΤ, το (STRVZ)NAT2 του στρεπτομύκητα του εδάφους Streptomyces zaomyceticus που παρουσίασε επιλεκτικότητα για τα υποστρώματα-δέκτες 2AP, π-ανισιδίνη (ANS) και 3,4-DCA, καθώς επίσης το (TSUPD)NAT1 του καρυνοβακτηρίου Tsukamurella paurometabola που παρουσίασε μεγαλύτερη επιλεκτικότητα για το υπόστρωμα-δότη μαλόνυλο συνένζυμο Α (malonyl-CoA), διατηρώντας ωστόσο χαμηλότερη ενεργότητα και με τα υπόλοιπα υποστρώματα-δότες που δοκιμάστηκαν. Το ομόλογο (TSUPD)NAT1 μελετήθηκε περαιτέρω και με κινητική ανάλυση έναντι των προτιμώμενων υποστρωμάτων δότη και δέκτη ακυλομάδας. Επιπροσθέτως, υπολογιστική στοίχιση της αμινοξικής αλληλουχίας, καθώς και μοντελοποίηση της τρισδιάστατης δομής του ομολόγου (TSUPD)NAT1 σε σχέση με άλλες γνωστές βακτηριακές πρωτεΐνες ΝΑΤ, αποκάλυψε μία ασυνήθιστη καταλυτική τριάδα αποτελούμενη από τα κατάλοιπα Cys, His και Glu αντί των συνηθισμένων Cys, His και Asp που χαρακτηρίζουν τη συγκεκριμένη οικογένεια ενζύμων.Ακολούθως, η έρευνα επεκτάθηκε στην πιλοτική εφαρμογή επιπλέον μεθοδολογιών, με σκοπό τη μελέτη του ενδοκυτταρικού ρόλου των μικροβιακών γονιδίων και πρωτεϊνών ΝΑΤ που χαρακτηρίστηκαν. Δοκιμάστηκε σειρά από μεθόδους λύσης βακτηριακών κυττάρων, ενώ πραγματοποιήθηκαν ακόμη δοκιμές μέτρησης της ενδογενούς ενζυμικής ενεργότητας ΝΑΤ με χρήση του αντιδραστηρίου του Ehrlich, καθώς επίσης και σχεδιασμός και εφαρμογή πρωτοκόλλων για απομόνωση βακτηριακού RNA, σύνθεση cDNA και εφαρμογή RT-PCR με απώτερο σκοπό την ανίχνευση της έκφρασης των γονιδίων ΝΑΤ. Αν και αντιμετωπίστηκαν δυσκολίες που παρεμπόδισαν την ολοκλήρωση αυτού του σκέλους της μελέτης, οι προσπάθειες αυτές ανοίγουν το δρόμο για μελλοντική έρευνα πάνω στον ενδογενή ρόλο των βακτηριακών πρωτεϊνών ΝΑΤ και τους παράγοντες που μπορεί να επηρεάζουν την έκφρασή τους στο κύτταρο, καθώς και την in vivo ενζυμική ενεργότητά τους.Τέλος, υποστηρίζοντας άλλη παράλληλη μελέτη του εργαστηρίου αναφορικά με τη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών ΝΑΤ στους μύκητες, εκφράστηκαν σε ανασυνδυασμένη μορφή έξι πρωτεΐνες ΝΑΤ από τους φυτοπαθογόνους ασκομύκητες Fusarium verticillioides και Fusarium graminearum, υπό συνθήκες που να επιτρέπουν την ενσωμάτωση του τροποποιημένου αμινοξέος L-σεληνομεθειονίνη (Se-Met) στην πολυπεπτιδική αλυσίδα, έτσι ώστε να καταστεί εφικτός μελλοντικά ο κρυσταλλογραφικός προσδιορισμός της τρισδιάστατης δομής τους. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη του ανασυνδυασμένου ισοενζύμου (GIBM7)NAT3 του F. verticillioides, έναντι του προτιμώμενου υποστρώματος-δότη ακυλομάδας (acetyl-CoA).Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτέλεσε αφετηρία μίας νέας διερεύνησης στο πεδίο, αποβλέποντας στη συγκριτική μοριακή γενετική και λειτουργική μελέτη των γονιδίων ΝΑΤ σε ένα ευρύ και αντιπροσωπευτικό ταξινομικό εύρος μικροοργανισμών. Επιπλέον, επέτρεψε περαιτέρω εξερεύνηση του ξενοβιοτικού μεταβολισμού των βακτηρίων, εστιάζοντας στα ένζυμα ΝΑΤ και προσδιορίζοντας λειτουργικές αποκλίσεις μεταξύ διαφορετικών ομολόγων. Παράλληλα, η πειραματική προσέγγιση που ακολουθήθηκε παρήγαγε πρωτότυπα υλικά (π.χ. κλώνους γονιδίων) τα οποία θα χρησιμεύσουν στη συνέχιση της έρευνας στο πεδίο.