Διαφορική έκφραση ανοσολογικών γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη και την επίκτητη ανοσία σε πειραματικές μολύνσεις λαβρακίου (Dicentrarchus labrax) με τον ιό Noda

Abstract

Greece, regarding the breeding of European Sea Bass (Dicentrarchus labrax), holds a leading position along with Turkey. However, the biggest problem faced by fish farming is the devastation of the fish fry due to the pathogenic attack or the development of fatal diseases, reducing their production and causing significant economic losses to the fish farmers.Nodavirus (family of Nodaviridae, Betanodavirus) infects over 30 species of Osteichthyes (popularly referred to as bony fish), including the European Sea Bass causing Viral Encephalopathy and Retinopathy (VER). The clinical symptoms of the disease are associated with lesions occurred the brain and the retina, causing kinetic abnormalities in the affected fish, loss of control of the bladder, difficulty in sight and darkening of the skin.The study of the immunopathology of the disease in order to identify biomarkers associated with defense mechanisms and the prognosis of the disease is of great importance for the understanding of the disease and the evaluation of a possible vaccine which is of course the most effective and more cost-effective way to control the disease.In addition, the evaluation of immunomodulators that enhance fish defense against pathogens are high priority objectives, as they contribute to reduce the use of antibiotics that affect both the quality of the product and the aquatic environment of fish farming.Among these Essential Oregano Oil, (oregano spp., family Lamiaceae) is known for its antioxidant and anti-microbial activity, attributable to its high content of carvacrol and thymol and also the p-cymene and gamma-monohydrate hydrocarbons, terpinene contained in lower concentrations. The aim of the PhD thesis was the development of RT-qPCRs for the determination of immunological markers associated with B and T cell functions, as well as cytokines in head-kidney of fish via two different experimental routes. More specifically, It was studied the expression of immunological genes after experimental intramuscular infection with b-nodavirus in the area below the dorsal fin with viral particles which are produced and titrated in vitro in cell lines (SSN-1). It is also performed an experimental infection by placing an impregnated filter paper with b-nodavirus in the middle of the lateral line. Finally, it was studied the expression of immunological genes in an experimentally infection in sea bass which was fed with Oregano Essential Oil (EO) at two different concentrations of 1000 and 2000 ppm.The results of the PhD Thesis, indicate the differential expression of immunological genes upon the two ways of experimental infection, compared to normal non infected fish. The viral challenge activates the immunological expression associated to the production of suppressive cytokines, e.g. IL-10, or T-helper cell receptors.Finally, the results of the doctoral thesis also suggest that the Oregano Essential Oil, delaying the intensity of the infection, and the diet enrichment could possibly make the fish more immune to viral infections.

Η Ελλάδα, όσον αφορά την καλλιέργεια λαβρακιού (Dicentrarchus labrax) κατέχει ηγετική θέση μαζί με την Τουρκία. Το μεγαλύτερο πρόβλημα που αντιμετωπίζει η συγκεκριμένη ιχθυοκαλλιέργεια είναι η καταστροφή του γόνου εξαιτίας της προσβολής του από παθογόνα ή η ανάπτυξη θανατηφόρων ασθενειών που ενσκήπτουν πλήττοντας διάφορες αναπτυξιακές φάσεις των ψαριών, περιορίζοντας την παραγωγή τους και επιφέροντας σημαντικές οικονομικές απώλειες στον κλάδο των ιχθυοκαλλιεργητών. Ο ιός Noda (οικογένεια Nodaviridae, γένος Betanodavirus) προσβάλει πάνω από 30 είδη ψαριών της κλάσης των οστεοϊχθείων, συμπεριλαμβανομένου και του λαβρακιού, προκαλώντας ιογενή εγκεφαλοπάθεια και αμφιβληστροειδοπάθεια (VER). Τα κλινικά συμπτώματα της ασθένειας συσχετίζονται με αλλοιώσεις που επισυμβαίνουν στον εγκέφαλο και τον αμφιβληστροειδή, προκαλώντας κινητικές ανωμαλίες στα προσβεβλημένα ψάρια, απώλεια ελέγχου της νηκτικής κύστης, δυσκολία στην όραση και σκούρο χρωματισμό του δέρματος. Η μελέτη της ανοσοπαθολογίας της ασθένειας με στόχο τον προσδιορισμό βιοδεικτών που σχετίζονται με τους αμυντικούς μηχανισμούς και την πρόγνωση της ασθένειας είναι μεγάλης σημασίας τόσο για την κατανόηση αυτής καθ΄ αυτής της ασθένειας, όσο και για την αξιολόγηση ενός πιθανού εμβολίου που θεωρείται, βεβαίως, ο αποτελεσματικότερος και οικονομικότερος τρόπος ελέγχου της ασθένειας. Επιπλέον, η αξιολόγηση ανοσοτροποποιητικών ουσιών που ενισχύουν την άμυνα των ψαριών εναντίον των παθογόνων αποτελούν στόχους υψηλής προτεραιότητας, καθόσον μπορούν να συμβάλλουν στον περιορισμό της χρήσης αντιβιοτικών που επιβαρύνουν τόσο την ποιότητα του προϊόντος, όσο και το υδάτινο περιβάλλον της ιχθυοκαλλιέργειας. Μεταξύ αυτών το αιθέριο έλαιο της ρίγανης (Origanum spp, οικογένεια Lamiaceae) είναι γνωστό για την αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή του δράση σε άλλα είδη, που αποδίδονται, κυρίως, στο υψηλό περιεχόμενό του σε καρβακρόλη και θυμόλη αλλά και λόγω των μονοτυρπενικών υδρογονανθράκων p-cymene και γ-terpinene που περιέχονται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις.Στόχος της διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη RT-qPCRs για τη μελέτη της διαφορικής έκφρασης ανοσολογικών γονιδίων που σχετίζονται με τη λειτουργία των Β και Τ κυττάρων, καθώς και με την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν για κυτταρομεσολαβητικούς παράγοντες, όπως είναι οι κυτταροκίνες, σε κύτταρα του πρόσθιου τμήματος του νεφρού λαβρακιού που έχει μολυνθεί πειραματικά με τον ιό Noda, με δυο οδούς χορήγησης.Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η έκφραση ανοσολογικών γονιδίων μετά από πειραματική μόλυνση με b-nodavirus κατόπιν ενδομυϊκής χορήγησης με ιικά σωματίδια που παρήχθηκαν και τιτλοποιήθηκαν in vitro σε κυτταρικές σειρές (SSN-1). Παράλληλα, διενεργήθηκε πειραματική μόλυνση με τοποθέτηση εμποτισμένου διηθητικού χαρτιού με διάλυμα ιού noda στο μέσο της πλευρικής γραμμής. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση ανοσολογικών γονιδίων μετά από μόλυνση με b-nodavirus σε πειραματικά μολυσμένα λαβράκια που διεγράφησαν με πειραματικό εμπλουτισμένο σιτηρέσιο με αιθέρια έλαια ρίγανης (ΕΟ) σε δυο διαφορετικές συγκεντρώσεις, 1000 και 2000 ppm.Tα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής υποδεικνύουν την διαφορική έκφραση των γονιδίων κατά την πειραματική μόλυνση και με τις δύο οδούς χορήγησης, σε σχέση με το φυσιολογικό πειραματισμό. Η ιική πρόκληση ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων, που σχετίζονται κυρίως με την παραγωγή κατασταλτικών κυτταροκινών, πχ IL-10, ή υποδοχέων των Τ-βοηθητικών κυττάρων. Τέλος, τα αποτελέσματα, επίσης υποδεικνύουν ότι το ριγανέλαιο καθυστερεί την εκδήλωση της λοίμωξης και ενδεχομένως ο εμπλουτισμός της τροφής των ψαριών θα τα καταστούσε περισσότερο ανοσοϊκανά έναντι των ιικών μολύνσεων, υποδηλώνοντας την ενεργοποίηση του ανοσολογικού συστήματος για την καταπολέμηση της ιικής προσβολής.