The functional role of nucleotide excision repair in transcription-associated DNA damage in mammals

Abstract

DNA is not disposable or recyclable and must be repaired when damaged. All other cellular polymers, including RNA, proteins and polysaccharides, are regularly turned over, broken down and rebuilt based on the blueprint provided by the genetic information stored in DNA. Thus, as the maintenance of DNA integrity is vital to the proper functioning of every cell, so is DNA damage inexorably linked to cellular dysfunction. To meet this challenge, mammalian cells have evolved machineries to maintain telomeres intact as well as overlapping repair pathways to counteract structural DNA modifications (e.g., nicks, gaps, DNA double-strand breaks (DNA DSBs), and the myriad alterations that may block DNA transcription or replication). For bulky helix-distorting damage, such as the main Ultraviolet (UV)-induced lesions, the principal repair mechanism is the evolutionarily conserved Nucleotide Excision Repair (NER) pathway. In humans and the corresponding animal models, inborn mutations in genes involved in NER are associated with a wide range of clinical symptoms whose remarkable heterogeneity cannot be adequately explained by the random accumulation of DNA damage. Recent studies revealed that, in addition to DNA repair, NER factors are also involved in transcription initiation and elongation, chromatin remodeling and the 3D genome architecture. To dissect the functional role of NER during mammalian development and disease, we used an in vivo biotinylation-tagging approach and unbiased high-throughput genomics and proteomics approaches techniques in mice. Here, we show that the NER structure-specific endonuclease ERCC1-XPF complex interacts with protein factors involved in the resolution of DNA topological stress that is triggered during the process of transcription. Upon induction of mRNA synthesis, we find that the ERCC1-XPF complex recruits on promoters, genome-wide and that its recruitment on DNA coincides with the presence of DNA DSBs on these genomic regions. Together, our findings point to the involvement of ERCC1-XPF in the repair of transcription-associated DNA damage events, shedding new light into the pathological complications associated with NER-deficient syndromes.

Σε αντίθεση με τις πρωτεΐνες και τα υπόλοιπα μακρομόρια π.χ. τα σάκχαρα ή τα λίπη, το πυρηνικό DNA (η απαρχή του RNA και των πρωτεϊνών) είναι αναντικατάστατο. Παρά το γεγονός ότι η χημική του σύσταση είναι εξαιρετικά ασταθής, το DNA οφείλει να διατηρηθεί αναλλοίωτο καθόλη τη διάρκεια της ζωής του κυττάρου ώστε η γενετική πληροφορία να κληρονομηθεί αυτούσια στα θυγατρικά κύτταρα. Ωστόσο, η ύπαρξη διαφόρων ενδογενών γενοτοξικών παραγόντων προκαλούν τη σταδιακή συσσώρευση πλήθους δομικών αλλοιώσεων και προσβολών (π.χ. υδρόλυση, απαμίνωση βάσεων, διμερισμός πυριμιδινών, δημιουργία θραυσμάτων μονής ή διπλής DNA έλικας κτλ.) στο DNA. Η επακόλουθη γενωμική αστάθεια επιφέρει δραματικές αλλαγές στη φυσιολογία του κυττάρου παρεμποδίζοντας τη φυσιολογική λειτουργία ζωτικών βιολογικών διεργασιών όπως η μεταγραφή ή/και ο αναδιπλασιασμός του DNA. Για να αντιμετωπίσουν την σταδιακή συσσώρευση DNA βλαβών, τα ευκαρυωτικά κύτταρα έχουν αναπτύξει ένα σύνολο αλληλεπικαλυπτόμενων επιδιορθωτικών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένου του μηχανισμού εκτομής νουκλεοτιδίων (Nucleotide Excision Repair, NER), που εντοπίζουν, επιδιορθώνουν και αποκαθιστούν το προσβαλλόμενο DNA στην αρχική του μορφή. Στον άνθρωπο και τα αντίστοιχα πειραματικά μοντέλα ποντικών, η ύπαρξη εγγενών μεταλλαγών σε γονίδια του μονοπατιού NER, προκαλεί ένα ευρύ φάσμα κλινικών συμπτωμάτων που χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ετερογένεια, η οποία δε μπορεί να εξηγηθεί αποκλειστικά λόγω της ατελούς επιδιόρθωσης του DNA. Πρόσφατες μελέτες απεκάλυψαν ότι ορισμένες πρωτεΐνες του NER συμμετέχουν, πέραν της επιδιόρθωσης των DNA βλαβών, σε κυτταρικές διεργασίες όπως η έναρξη της μεταγραφής και η αναδιαμόρφωση ή ο σχηματισμός της τρισδιάστατης δομής της χρωματίνης στο χώρο. Για να διαλευκάνουμε το λειτουργικό ρόλο του NER στην ανάπτυξη και τις ασθένειες στα θηλαστικά, αναπτύξαμε την μέθοδο της in vivo σήμανσης με βιοτίνη της πρωτεΐνης XPF στον ποντικό. Η προσέγγιση αυτή σε συνδυασμό με μεθοδολογίες αλληλούχισης DNA υψηλής απόδοσης και λειτουργικές προσεγγίσεις απεκάλυψαν ότι το ετεροδιμερές του συμπλόκου ενδονουκλεάσης του NER ERCCI-XPF αλληλεπιδρά με πρωτεϊνικούς παράγοντες που συμμετέχουν στην μεταγραφή και την εξομάλυνση του τοπολογικού φόρτου του DNA κατά την διαδικασία της μεταγραφής. Συγκεκριμένα, ανιχνεύσαμε ότι κατά την επαγωγή της μεταγραφής, η ERCC1-XPF προσδένεται σε υποκινητές, κατά μήκος του γονιδιώματος. Επιπλέον μελέτες απεκάλυψαν ότι η πρόσδεση του συμπλόκου ERCC1-XPF στο DNA, συμπίπτει με την δημιουργία εκτομών διπλού θραύσματος στο DNA (DNA double strand breaks, DSBs) σε διακριτές περιοχές του DNA. Τα αποτελέσματα της μελέτης αναδεικνύουν τον λειτουργικό ρόλο της ERCC1-XPF στην επιδιόρθωση DNA βλαβών που προκαλούνται κατά την διαδικασία της μεταγραφής και παρέχουν ένα μηχανιστικό μοντέλο που εξηγεί ικανοποιητικά την κλινική ετερογένεια των συνδρόμων NER.