Μελέτη των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην παθογένεση του μεταβολικού συνδρόμου με μεθόδους βιολογίας συστημάτων

Abstract

Metabolic syndrome (MetS) is a multifactorial disorder characterized by the presence of several comorbidities that predispose to cardiovascular disease and diabetes. Long-term exposure to excess dietary fat is a predominant factor that leads to obesity and MetS. However, the presently available animal models to study the molecular mechanisms underlying the MetS pathology have significant limitations. The purpose of the present study was first to identify global gene expression changes in metabolic tissues and circulating miRNAs in a humanized mouse model of diet-induced MetS, the apoE3L.CETP mice. Secondly, we aimed to assess the impact of hepatic FOXO1 ablation in apoE3L.CETP mice during the development of MetS.Male apoE3L.CETP mice received a high (HFD) or a low (LFD) fat diet for different time periods and the progression of MetS pathology was monitored. In a parallel study that was performed in collaboration with the group of Dr Thomas Lutz in Zurich, a separate group of mice was divided into responders (R) or non-responders (NRs) and received the same HFD for 16 weeks. The hepatic transcriptome was analyzed by Affymetrix expression arrays. We found that mice receiving the HFD progressively developed manifestations of MetS and displayed an increasing number of differentially expressed transcripts at 4, 8 and 12 weeks compared to LFD. Significantly changed genes were functionally annotated to metabolic diseases including insulin resistance, hepatic steatosis, metabolic syndrome and disorders of glucose and lipid metabolism. Pathway analysis revealed the downregulation of genes in cholesterol and fatty acid biosynthesis whereas genes of glycolysis or gluconeogenesis were not changed. A group of genes related to lipid droplet formation was upregulated in the HFD group and this was in line with the development of hepatic steatosis in these mice. In the serum of the apoE3L.CETP mice we identified 3 miRNAs that were up-regulated in the HFD group but not in the LFD group. We found that responder mice have a distinct gene signature that differentiates them from mice that do not respond well to the diet. The comparison of two diet intervention studies (HFD vs LFD and R vs NR) revealed a limited number of common differentially expressed genes but the expression of the common genes were affected in a similar way in both studies. As a following step, we sought to identify transcriptomic changes in the liver that are related to bariatric interventions in the context of MetS. Improvement of comorbidities in the MetS and sustained weight loss can be achieved by the Roux-en-Y gastric bypass (RYGB) surgical operation. For this purpose, we collaborated with the same group in Zurich in order to obtain liver samples and perform transcriptomics. Male apoE3L.CETP mice were fed a HFD diet for 6 weeks and underwent RYGB or Sham surgery. Sham groups were either fed ad libitum or were body weight-matched to the RYGB mice, to discriminate and identify surgical effects from body weight loss associated effects. RYGB-operated mice achieved a significant weight loss. In addition, RYGB surgery ameliorated the glucose metabolism and lipid metabolism, and altered hepatic transcriptome according to the global transcriptomic analysis in the livers of RYGB, Sham AL and BWm groups of mice. The comparison of the RYGB mice to BWm or Sham AL mice revealed 1137 (656↑, 481↓) and 411 s (300↑, 206↓) differentially expressed transcripts respectively. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) indicated that the observed gene expression changes in the three different comparison groups were mainly associated with the lipid metabolism such as “concentration of lipid, fatty acid metabolism, concentration of cholesterol, and synthesis of lipid” at the level of biological functions. In addition, we examined the transcriptomic alterations that occur in the gonadal white adipose tissue (gWAT) of apoE3L.CETP mice in discrete stages of the development of MetS since WAT is a major determinant of metabolic health and disease. Adipose RNA was analyzed on Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST arrays followed by bioinformatical analysis. The microarray analysis revealed that the transcriptomic profile of WAT was more robustly altered compared with the hepatic transcriptome in apoE3L.CETP mice. Indeed, the statistical analysis of transcriptomic data under specific criteria (p-value < 0.05 and |log2FC(fold change) |≥1.5) yielded a total of 481, 946 and 1377 genes that were found to be differentially expressed between the HFD and the LFD groups of mice at 4, 8 and 12 weeks, respectively. Functional analysis allowed identifying sets of genes significantly enriched with immune and inflammatory responses, especially at 8 and 12w. Moreover, a large number of genes related to extracellular matrix (ECM) were found to be differentially expressed, suggesting tissue remodeling during the progression of MetS. The downregulation of metabolic pathways including Glycolysis, Cholesterol Biosynthesis and Fatty Acid Biosynthesis, could be associated with a modulation of nutrients metabolism upon HFD feeding. Finally, genes with an established role in the regulation of adipose metabolism and maintenance or with a systemic effect in whole-body homeostasis were differentially expressed during MetS progression, including the leptin (lep), the glucose transporter, Slc2a4 (Solute carrier family 2, member 4), the Insulin receptor substrate 1 (Irs1) and the Cidea (cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha-like effector A). To elucidate the effect of FOXO1 silencing in the liver of apoE3L.CETP mice during the MetS progression, adult male mice were intravenously injected with the AAV-sc-RNA as control group or with the AAV-sh-Foxo1. All mice were fed a chow diet for 15 weeks post-injection before switching to a HFD for 3 months. Animals were monitored for their body weight, lipid profile, glucose levels and glucose tolerance before and after the diet intervention. We identified a reduction of FOXO1 at both mRNA and protein levels in certain sh-FOXO1 mice (5 out of 11 mice). Moreover, fluorescent microscopy revealed FOXO1 localization in the nuclei of the control group, whereas FOXO1 was barely detectable in the AAV-shFOXO1 group. The silencing of FOXO1 in the liver of apoE3L.CETP mice induced alterations only in some clinical circulating parameters. More precisely, the clinical characterization of mice revealed that there were no significant differences in glucose and lipid measurements at baseline and additionally histological alterations were similar to both groups of mice, related to HFD feeding. Importantly, there were significant systemic improvements concerning the glucose tolerance and the insulin sensitivity. Furthermore, RNA sequencing analysis revealed a significant response of hepatic transcriptome and of the skeletal muscles transcriptome to a less extent. Regarding hepatic transcriptomic changes, genes related to FOXO signaling pathway (mmu04068) and also to Insulin resistance (mmu04931) were down-regulated such as the insulin receptor (Insr, p-0.019758593), up-stream of FOXO1 signaling cascade. Gluconeogenesis may be reduced due to significant ablation of FOXO1 and relevant pathways that could regulate the glucose production and uptake when the HFD increases fasting blood glucose in both groups during the MetS progression. These data claim that FOXO1 modulation could be a therapeutic approach to counterfeit key-components of the MetS. In summary, the present transcriptomic analysis in the livers and the sera of apoE3L.CETP mice receiving a HFD or a LFD and in the livers of apoE3L.CETP mice subjected to RYGB surgery, combined with extensive bioinformatics analysis, revealed characteristic hepatic gene signatures, indicative of the molecular changes that occur at the different stages of the pathogenesis of the MetS. This approach was further completed by the transcriptomic signatures identified in the WAT of apoE3L.CETP mice and the clinical alterations that were observed after the hepatic silencing of FOXO1 in the context of MetS progression. Collectively, the patterns of gene expression and serum miRNAs identified in the present study provide a detailed insight to MetS pathology and could be exploited for diagnostic or therapeutic purposes.

Το Μεταβολικό Σύνδρομο (ΜΣ) αποτελεί μία πολυπαραγοντική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από ένα σύμπλεγμα συνοδών νοσημάτων τα οποία προδιαθέτουν για την εκδήλωση καρδιαγγειακών νοσημάτων και διαβήτη. Η μακροχρόνια λήψη διατροφής πλούσιας σε λιπαρά αποτελεί βασικό παράγοντα για την ανάπτυξη παχυσαρκίας και ΜΣ. Ωστόσο, τα μέχρι στιγμής διαθέσιμα ζωικά μοντέλα για τη μελέτη των μοριακών μηχανισμών που αποτελούν τη βάση της παθολογίας του ΜΣ έχουν σημαντικούς περιορισμούς. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν αρχικά να προσδιοριστούν οι αλλαγές της συνολικής γονιδιακής έκφρασης σε μεταβολικούς ιστούς καθώς και οι αλλαγές των κυκλοφορούντων miRNAs σε ένα μοντέλο ποντικού με επαγόμενο μέσω της διατροφής ΜΣ, τους ποντικούς apoE3L.CETP. Δεύτερον, επιδιώξαμε να αξιολογήσουμε την επίδραση της αποσιώπησης του μεταγραφικού παράγοντα FOXO1 στο ήπαρ ποντικών apoE3L.CETP κατά την ανάπτυξη του ΜΣ.Σε αρσενικούς ποντικούς apoE3L.CETP χορηγήθηκε δίαιτα με υψηλή (HFD) ή χαμηλή (LFD) περιεκτικότητα σε λιπαρά για διαφορετικές χρονικές περιόδους και παρακολουθήθηκε η εξέλιξη της παθολογίας ΜΣ. Σε μια παράλληλη μελέτη που έγινε σε συνεργασία με την ομάδα του Δρα Thomas Lutz στην Ζυρίχη, μια ξεχωριστή ομάδα ποντικών χωρίστηκε σε ανταποκρινόμενους (R) ή μη ανταποκρινόμενους (NR) και έλαβε την ίδια HFD δίαιτα για 16 εβδομάδες. Το μεταγραφικό προφίλ του ήπατος αναλύθηκε σε μικροσυστοιχίες της Affymetrix. Διαπιστώσαμε ότι οι ποντικοί που έλαβαν HFD δίαιτα ανέπτυξαν προοδευτικά εκδηλώσεις του ΜΣ και ένας αυξανόμενος αριθμός διαφορικά εκφρασμένων μεταγράφων ταυτοποιήθηκε στις 4, 8 και 12 εβδομάδες σε σύγκριση με τους ποντικούς που έλαβαν την LFD. Σημαντικά αλλαγμένα γονίδια συσχετίστηκαν λειτουργικά με μεταβολικές ασθένειες που περιλαμβάνουν την ανοχή στην ινσουλίνη, την ηπατική στεάτωση, το μεταβολικό σύνδρομο και διαταραχές του μεταβολισμού της γλυκόζης και των λιπιδίων. Η ανάλυση των μοριακών μονοπατιών αποκάλυψε την υποέκφραση των γονιδίων βιοσύνθεσης της χοληστερόλης και των λιπαρών οξέων, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή σε γονίδια της γλυκόλυσης ή της γλυκονεογένεσης. Μία ομάδα γονιδίων που σχετίζονται με σχηματισμό σταγονιδίων λιπιδίων βρέθηκε ότι υπερεκφράζονται στην ομάδα HFD και αυτό ευθυγραμμίζεται με την ανάπτυξη της ηπατικής στεάτωσης στους συγκεκριμένους ποντικούς. Στον ορό των ποντικών apoE3L.CETP ταυτοποιήσαμε 3 miRNAs τα οποία υπερκφράζονται στην ομάδα HFD αλλά όχι στην ομάδα LFD. Βρήκαμε ότι οι ποντικοί που αποκρίνονται στη δίαιτα (R) έχουν ξεχωριστή γονιδιακή υπογραφή που τα διαφοροποιεί από ποντικούς που δεν ανταποκρίνονται καλά στη διατροφή (NR). Η σύγκριση των δύο μελετών διατροφικής παρέμβασης (HFD έναντι LFD και R έναντι NR) αποκάλυψε έναν περιορισμένο αριθμό κοινών διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, ωστόσο η έκφραση των κοινών γονιδίων επηρεάστηκε με παρόμοιο τρόπο και στις δύο μελέτες.Ως επόμενο βήμα, επιδιώξαμε να εντοπίσουμε μεταγραφικές αλλαγές στο ήπαρ που σχετίζονται με βαριατρικές επεμβάσεις στο πλαίσιο του ΜΣ. Η βελτίωση των συνοδών νοσημάτων του ΜΣ και η συνεχής και μακροπρόθεσμη απώλεια βάρους μπορούν να επιτευχθούν με τη γαστρική παράκαμψη Roux-en-Y (RYGB). Για το σκοπό αυτό, συνεργαστήκαμε με την ίδια επιστημονική ομάδα στη Ζυρίχη προκειμένου να λάβουμε δείγματα ήπατος και να εκτελέσουμε μεταγραφωματικές αναλύσεις. Σε αρσενικούς ποντικούς apoE3L.CETP χορηγήθηκε δίαιτα HFD για 6 εβδομάδες και κατόπιν οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση RYGB ή υπέστησαν χειρουργική επέμβαση χωρίς εφαρμογή βαριατρικής μέθοδου ως ομάδα έλεγχου (Sham). Οι ομάδες ελέγχου είτε έλαβαν τροφή σε συνθήκες ad libitum είτε στερηθηκαν τροφής ώστε να επιτύχουν την απώλεια βάρους σώματος ανάλογη των ποντικών που εγχειρήθηκαν (Body Weight Matced, BWm), για τη διάκριση και τον εντοπισμό των χειρουργικών επιδράσεων από σχετιζόμενα με την απώλεια σωματικού βάρους αποτελέσματα. Οι ποντικοί που χειρουργήθηκαν με RYGB πέτυχαν σημαντική απώλεια βάρους. Επιπρόσθετα, η χειρουργική επέμβαση RYGB βελτίωσε τον μεταβολισμό της γλυκόζης και το μεταβολισμό των λιπιδίων και τροποποίησε το ηπατικό μεταγράφωμα σύμφωνα με την ανάλυση σφαιρικών αλλαγών του μεταγραφώματος στο ήπαρ των ομάδων ποντικών Rygb, Sham ΑL και BWm. Η σύγκριση των ποντικών RYGB με BWm ή Sham AL ποντίκια αποκάλυψε 1137 διαφορικά εκφρασμένα μετάγραφα (656 ↑, 481 ↓) και 411 μετάγραφα (300 ↑, 206 ↓), αντίστοιχα. Η ανάλυση με το λογισμικό πρόγραμμα “Ingenuity Pathway Analysis” (IPA) έδειξε ότι οι παρατηρούμενες αλλαγές γονιδιακής έκφρασης στις τρεις διαφορετικές ομάδες που συγκρίθηκαν σχετίζονταν κυρίως με τον μεταβολισμό των λιπιδίων όπως η «συγκέντρωση των λιπιδίων, του μεταβολισμού των λιπαρών οξέων, της συγκέντρωσης της χοληστερόλης και της σύνθεσης των λιπιδίων» στο επίπεδο των βιολογικών λειτουργιών.Επιπρόσθετα, εξετάσαμε τις μεταγραφικές μεταβολές που εμφανίζονται στον γοναδικό λευκό λιπώδη ιστό (gWAT) των ποντικών apoE3L.CETP σε διακριτά στάδια ανάπτυξης του ΜΣ, καθώς ο λιπώδης ιστός είναι βασικός καθοριστικός παράγοντας της μεταβολικής υγείας και των μεταβολικών διαταραχών. Το RNA από τον λιπώδη ιστό αναλύθηκε σε μικροσυστοιχίες Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST, ενώ ακολούθησε βιοπληροφορική ανάλυση. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών αποκάλυψε ότι το μεταγραφικό προφίλ του λιπώδους ιστού (WAT) μεταβλήθηκε σε μεγάλο βαθμό σε σύγκριση με το ηπατικό μεταγραφικό προφίλ σε ποντικούς apoE3L.CETP. Πράγματι, η στατιστική ανάλυση των δεδομένων του μεταγραφώματος κάτω από συγκεκριμένα κριτήρια (p <0.05 και | log2FC (λόγος μεταβολής) | ≥1.5) ανέδειξε συνολικά 481, 946 και 1377 γονίδια τα οποία βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ομάδων ποντικών HFD και LFD στις 4, 8 και 12 εβδομάδες, αντίστοιχα. Η λειτουργική ανάλυση επέτρεψε την ταυτοποίηση μιας σειράς γονιδίων που εμπλέκονται σε στατιστικά σημαντικές ανοσολογικές και φλεγμονώδεις αποκρίσεις, ειδικά στις 8 και 12 εβδομάδες. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που σχετίζονται με την εξωκυττάρια ουσία (ECM) εκφράζεται διαφορικά, υποδηλώνοντας την αναδιαμόρφωση του ιστού κατά την εξέλιξη του ΜΣ. Η υποέκφραση των μεταβολικών μονοπατιών, συμπεριλαμβανομένων της Γλυκόλυσης, της Βιοσύνθεσης της Χοληστερόλης και της Βιοσύνθεσης των Λιπαρών Οξέων, θα μπορούσε να συσχετιστεί με τη ρύθμιση του μεταβολισμού των θρεπτικών συστατικών κατά την χορήγηση δίαιτας HFD. Τέλος, γονίδια με αναγνωρισμένο ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού του λιπώδους ιστού και την εύρυθμη διατήρησή του ή με συστημική επίδραση στην ομοιόσταση ολόκληρου του οργανισμού βρέθηκε ότι εκφράζονται διαφορικά κατά την εξέλιξη του ΜΣ, συμπεριλαμβανομένης της λεπτίνης (lep), του μεταφορέα γλυκόζης, Slc2a4 (Solute carrier family 2, member 4), του υποδοχέα Insulin receptor substrate 1 (Irs1) και του γονιδίου Cidea (cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha-like effector A).Για να διαλευκανθεί η επίδραση της αποσιώπησης του μεταγραφικού παράγοντα FOXO1 στο ήπαρ των ποντικών apoE3L.CETP κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του ΜΣ, ενήλικοι αρσενικοί ποντικοί ενέθηκαν ενδοφλέβια με τους ανασυνδυασμένους συσχετιζόμενους ιούς AAV-scControl ως ομάδα ελέγχου ή με τους AAV-sh-FΟΧΟ1. Όλοι οι ποντικοί διατρέφονταν με συμβατική δίαιτα για 15 εβδομάδες μετά την ένεση πριν μεταβούν σε δίαιτα HFD για 3 μήνες. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν για το σωματικό τους βάρος, το λιπιδιακό προφίλ και τα επίπεδα γλυκόζης πριν και μετά την διατροφική παρέμβαση. Εντοπίσαμε μια μείωση του FOXO1 τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεϊνών σε ορισμένους sh-FOXO1 ποντικούς (5 από τους 11 ποντικούς). Επιπλέον, με την χρήση μικροσκοπίας φθορισμού προχωρήσαμε στον εντοπισμό του FOXO1 στους πυρήνες της ομάδας ελέγχου, ενώ ο FOXO1 ανιχνεύθηκε οριακά στην ομάδα AAV-shFOXO1. Η αποσιώπηση του FΟΧΟ1 στο ήπαρ των ποντικών apoE3L.CETP προκάλεσε μεταβολές μόνο σε ορισμένες κλινικές παραμέτρους της κυκλοφορίας. Πιο συγκεκριμένα, ο κλινικός χαρακτηρισμός των ποντικών έδειξε ότι δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της γλυκόζης και των λιπιδίων και επιπλέον οι ιστολογικές μεταβολές ήταν παρόμοιες και στις δύο ομάδες ποντικών, και σχετίζονται με την δίαιτα HFD. Είναι σημαντικό ότι υπήρξε σημαντική βελτίωση όσον αφορά την ανοχή στη γλυκόζη και την ευαισθησία στην ινσουλίνη σε συστημικό επίπεδο. Επιπλέον, η ανάλυση αλληλούχισης του RNA αποκάλυψε μια σημαντική απόκριση του ηπατικού μεταγραφώματος και σε μικρότερο βαθμό του μεταγραφώματος των σκελετικών μυών. Σχετικά με τις αλλαγές στο μεταγράφωμα του ήπατος, τα γονίδια που σχετίζονται με το μονοπάτι σηματοδότησης FOXO (mmu04068) και επίσης με την αντίσταση στην ινσουλίνη (mmu04931) βρέθηκε ότι υποεκφράζονται, όπως ο υποδοχέας ινσουλίνης (Insr, ρ-0.019758593), προς τα πάνω του καταρράκτη σηματοδότησης FOXO1. Η γλυκονογένεση μπορεί να μειωθεί λόγω της σημαντικής κατάλυσης του FOXO1 και σχετικών οδών που θα μπορούσαν να ρυθμίσουν την παραγωγή και πρόσληψη γλυκόζης όταν η HFD αυξάνει τη γλυκόζη αίματος νηστείας και στις δύο ομάδες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του MetS. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι ο έλεγχος του FOXO1 θα μπορούσε να αποτελέσει θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση βασικών στοιχείων της παθολογίας του ΜΣ.Συνοψίζοντας, η παρούσα μεταγραφωματική ανάλυση στο ήπαρ και στον ορό ποντικών apoE3L.CETP που έλαβαν δίαιτα HFD ή LFD και στο ήπαρ ποντικών apoE3L.CETP που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση RYGB, συνδυάστηκε με εκτεταμένη ανάλυση βιοπληροφορικής, αποκαλύπτοντας χαρακτηριστικές γονιδιακές υπογραφές του ήπατος, ενδεικτικές των μοριακών μεταβολών που εμφανίζονται στα διάφορα στάδια της παθογένεσης του ΜΣ. Αυτή η προσέγγιση ολοκληρώθηκε περαιτέρω μέσα από τον χαρακτηρισμό μεταγραφικών υπογραφών στον λιπώδη ιστό των ποντικών apoE3L.CETP και μέσα από την αξιολόγηση των κλινικών μεταβολών που παρατηρήθηκαν μετά την αποσιώπηση του FOXO1 στο ήπαρ στο πλαίσιο της εξέλιξης του ΜΣ. Συνολικά, τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης και κυκλοφορούντων miRNAs που προσδιορίστηκαν στην παρούσα μελέτη παρέχουν μια λεπτομερή εικόνα της παθολογίας του ΜΣ και θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για διαγνωστικούς ή θεραπευτικούς σκοπούς.