Επίδραση των οξυγαλακτικών βακτηρίων και των συνθηκών παραγωγής και συντήρησης ζυμωμένων γαλακτοκομικών προϊόντων στα κατάλοιπα της φαινβενδαζόλης και των μεταβολιτών της

Abstract

The purpose of this thesis was the development of a simple, rapid, sensitive liquid chromatographic method for the determination of fenbendazole (FBZ) and its three major metabolites (OFZ, FBZ-OH, FBZ-SO2) in fermented dairy products, validated according to the Decision 2002/657 of the Commission of the European Communities guidelines. A mixture of acetonitrile-0.1 M phosphoric acid was used for the sample extraction, defatting of extracts with hexane and further partitioning with ethyl acetate. Separation of FBZ and its metabolites was carried out isocratically with a mobile phase containing sodium 1-octanosulphonate and tetrabutylammonium hydrogen sulphate and stationary phase. Detection was performed at 290 nm using a photodiode-array detector. The method has been successfully applied to quantitate FBZ residues and its metabolites in yoghurt and Feta cheese samples from spiked and incurred ovine milk. Overall recoveries ranged from 79.9 to 88.8%, overall relative standard deviation from 6.3 to 11.0% and limits of quantification from 9.9 to 20.9 μg/kg. The second experimental phase focused on the investigation of the ability of lactic acid strains Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus and Str. thermophilus to reduce the concentration of FBZ residues and its metabolites. As part of this investigation, experiments with bacterial cells that were washed twice, minimal salts medium, MRS and M17 broth were carried out. The spiking with FBZ and its metabolites, however, showed no evidence of binding or biodegradation ability of lactic acid strains during the incubation at 37oC for 7 days. Furthermore, the effect of production and storage conditions in yoghurt and Feta cheese samples from ovine milk that was spiked with FBZ and its metabolites was investigated. Fermented milks inoculated with Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus and Str. thermophilus as well as yoghurt were spiked, and the results showed remarkable reduction of the four analytes’ concentration during storage at 4oC for 15 days in dependence to bacterial strain at inoculation. The reduction of their concentration may occur because of the binding or biodegradation ability of lactic acid strains in combination with the acidic conditions in such fermented products. Moreover, in spiked Feta cheese samples from ovine milk, the reduction of FBZ and its metabolites’ concentration was significant at all sampling times during storage at 4oC for 360 days, possibly because of the binding or biodegradation ability of the strains in the lactic acid starter culture (Lb. bulgaricus and Str. thermophilus) in combination with acidic conditions. All the above-mentioned experiments were repeated by using ovine milk from 30 healthy animals treated with one bolus of FBZ (250 mg) per os. The milk was collected separately from three consecutive milkings (12 h intervals) and was used for the production of Feta cheese. Reduction of FBZ and its metabolites’ concentration was observed, possibly because of the binding or biodegradation ability of strains in the starter culture (Lb. bulgaricus and Str. thermophilus), the acidic conditions in Feta cheese, the losses caused from the separation of curd from whey and the metabolism of FBZ in sheep.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διαμόρφωση μιας νέας αξιόπιστης μεθόδου προσδιορισμού χαμηλών συγκεντρώσεων της φαινβενδαζόλης (FBZ) και των τριών κύριων μεταβολιτών της (OFZ, FBZ-OH, FBZ-SO2) σε ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα και σε θρεπτικά υποστρώματα ανάπτυξης των οξυγαλακτικών βακτηρίων. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε και επιβεβαιώθηκε σύμφωνα με την Απόφαση 2002/657 της Ευρωπαϊκής Επιτροπής, είναι μία απλή, γρήγορη και ευαίσθητη μέθοδος προσδιορισμού των καταλοίπων της FBZ και των μεταβολιτών της σε ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα καθιστώντας δυνατή την κατεργασία και υγροχρωματογραφική ανάλυση 15 δειγμάτων σε συνολικό χρόνο περίπου 8 ωρών. Η επεξεργασία του δείγματος περιελάμβανε την εκχύλιση με μίγμα ακετονιτριλίου-1 Μ φωσφορικού οξέος, την απολίπανση με κατανομή σε εξάνιο και την περαιτέρω εκχύλιση των ουσιών με οξικό αιθυλεστέρα. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός της FBZ και των μεταβολιτών της διενεργήθηκε ισοκρατικά, με κινούμενη φάση που περιείχε όξινο θειϊκό τετραβουτυλαμμώνιο και 1-οκτανοσουλφονικό νάτριο και στατική φάση. Η ανίχνευση των ουσιών έγινε με φασματοφωτομετρικό ανιχνευτή συστοιχίας διόδων σε μήκος κύματος 290 nm. Η ολική ανάκτηση της μεθόδου ήταν 79,9-88,8%, η σχετική τυπική απόκλιση των αποτελεσμάτων 6,3-11,0% και τα όρια ποσοτικού προσδιορισμού 9,9-20,9 μg/kg για τη γιαούρτη και τη Φέτα. Το δεύτερο μέρος της διατριβής αφορούσε στην διερεύνηση της ικανότητας των οξυγαλακτικών στελεχών Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus και Str. thermophilus να επιδρούν στη συγκέντρωση των καταλοίπων της FBZ και των μεταβολιτών της. Πραγματοποιήθηκαν πειραματισμοί με καθαροποιημένες καλλιέργειες οξυγαλακτικών βακτηρίων, ειδικό υπόστρωμα αλάτων Μ9 αλλά και θρεπτικούς ζωμούς MRS και M17, όπου δεν διαπιστώθηκε ικανότητα των στελεχών να δεσμεύουν ή/και να αποδομούν τη FBZ και τους μεταβολίτες της κατά την επώαση στους 37oC για 7 ημέρες. Επιπλέον, διερευνήθηκε η τύχη των καταλοίπων της FBZ και των μεταβολιτών της κατά την παραγωγή και συντήρηση της γιαούρτης και της Φέτας, που παρασκευάστηκαν από πρόβειο γάλα που επιβαρύνθηκε με τη FBZ και τους μεταβολίτες της. Στους πειραματισμούς με γιαούρτη και άλλα ζυμωμένα γάλατα ενοφθαλμισμένα με τα 5 οξυγαλακτικά στελέχη, τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μείωση της συγκέντρωσης των ουσιών σε σχέση με τον χρόνο συντήρησης (4oC για 15 ημέρες), αλλά και με το οξυγαλακτικό στέλεχος που ενοφθαλμίστηκε και οφείλεται πιθανόν στη δέσμευση ή/και στη βιοαποδόμησή τους από τα στελέχη, σε συνδυασμό με το όξινο pH των προϊόντων. Ομοίως, στους πειραματισμούς που διενεργήθηκαν σε Φέτα από πρόβειο γάλα που επιβαρύνθηκε με την κάθε ουσία, διαπιστώθηκε σημαντική μείωση της συγκέντρωσης των ουσιών σε σχέση με τον χρόνο συντήρησης (4oC, 360 ημέρες), που θα μπορούσε να αποδοθεί στην ικανότητα των στελεχών της οξυγαλακτικής καλλιέργειας (Lb. bulgaricus και Str. thermophilus), να δεσμεύουν ή/και να αποδομούν τη FBZ και τους μεταβολίτες της στη Φέτα, σε συνδυασμό με το όξινο pH. Όλοι οι παραπάνω πειραματισμοί επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας γάλα από 30 υγιείς προβατίνες, στις οποίες χορηγήθηκε FBZ (250 mg) από το στόμα και στη συνέχεια το γάλα τριών διαδοχικών αμέλξεων (12ωρα διαστήματα) συλλέχθηκε και τυροκομήθηκε χωριστά. Σε όλα τα δείγματα παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της συγκέντρωσης της FBZ και των μεταβολιτών της που θα μπορούσε να αποδοθεί στη δέσμευση ή/και στη βιοαποδόμησή τους από τα στελέχη της οξυγαλακτικής καλλιέργειας, σε συνδυασμό πιθανόν με το όξινο pH, το μεταβολισμό της ουσίας στον οργανισμό του ζώου και τη διαφυγή μέρους της συγκέντρωσης με το τυρόγαλα.