Ανίχνευση και ταυτοποίηση με κλασικές και μοριακές τεχνικές του αιτιολογικού παράγοντα της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας σε ασθενείς με κίρρωση

Abstract

Spontaneous bacterial peritonitis (SBP) is a frequent and severe complication of cirrhotic patients with ascites. It was defined for the first time in 1971 by Conn as a bacterial infection of the ascitic fluid (AF) in the absence of a focal contiguous source. The key mechanism of the pathogenesis of SBP is bacterial translocation (BT), defined as the passage of viable gut flora through the intestinal barrier to extra-luminal sites. It is τhe most frequent infectious complication in patient with cirrhosis. SBP is diagnosed on the basis of PMN cell counts equal or greater than 250 cells/mm3 in AF, regardless the result of the ascites culture. It is known that, in a high proportion of SBP patients, cultures of AF remain negative, probably due to the relative low concentration of bacteria in ascitic fluid (1 bacteria/ml). In general practice, ascites culture is negative in approximately 60% of SBP patients, despite the inoculation of ascites directly into blood culture bottles (AF vial cultures) at the bedside. Molecular assays have been widely used for detection of microorganisms directly to clinical specimens.In this study, we assessed the value of broad range 16S rRNA PCR applied either directly to ascitic fluid or to the ascitic fluid vial cultures, compared to the standard of care that includes ascitic fluid vial culture.A total of 150 ascitic fluids (39 non portal hypertension and 111 portal hypertension) obtained from individual patients, were collected. SBP was diagnosed in 32 of them. Ten ml of each ascitic fluid were inoculated into blood culture bottles at the patients’ bedside and were inoculated for a period of 14 days. In addition, 10 ml of ascitic fluid were also obtained for molecular analysis. Broad range 16S rRNA PCR was applied directly to ascitic fluid and to the ascitic fluid vial cultures after the incubation period. PCR amplicons were sequenced in both directions and were compared with those submitted to GenBank and EMBL, using the BLAST algorithm.Four out 32 AF vial cultures (12.5%) were found to be positive for Escherichia coli. The application of 16S rRNA PCR directly to AF detected only one of the four positive samples [sensitivity 25%, specificity 100%, positive predictive value (PPV) 100%, negative predictive value (NPV) 90.32%]. However, the application of 16S rRNA PCR to AF vial cultures after 14 days of incubation correctly identified all the positive samples, including one more that was positive for Brucella mellitensis (sensitivity 100%, specificity 80%, PPV 80%, NPV 100%). The elongation of the incubation period of the AF vial cultures, combined with the use of 16S rRNA in negative vials, increases the possibility of identifying the causative agents of SBP and could be applied in the clinical laboratory.

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι μια συχνή και σοβαρή επιπλοκή που αφορά στους ασθενείς με ασκίτη. Ορίστηκε για πρώτη φορά το 1971 ως η περιτονίτιδα που εμφανίζεται σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος και συνοδό ασκίτη, στην οποία δεν ανευρίσκεται ενδοκοιλιακή πηγή λοίμωξης που να απαιτεί χειρουργική αντιμετώπιση (δευτεροπαθής βακτηριακή περιτονίτιδα). Κύριος παθογενετικός μηχανισμός της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας είναι η βακτηριακή διαμετάθεση, που ορίζεται ως η δίοδος ζώντων μικροβίων της εντερικής χλωρίδας, διαμέσου του εντερικού τοιχώματος σε εξωαυλικές εντοπίσεις. Είναι η πιο συχνή επιπλοκή λοιμώδους αιτιολογίας στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η διάγνωσή της βασίζεται στην αύξηση του απόλυτου αριθμού των πολυμορφοπύρηνων στο ασκιτικό υγρό ≥250 κύτταρα/mm3, ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα της καλλιέργειας του ασκιτικού υγρού. Ωστόσο η απομόνωση και η ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα της λοίμωξης είναι πολύ σημαντική για τη χορήγηση της κατάλληλης αντιμικροβιακής θεραπείας. Σε μεγάλο ποσοστό ασθενών (60%) με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα, η καλλιέργεια, η οποία προτείνεται να γίνεται με ενοφθαλμισμό του ασκιτικού υγρού σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών «παρά τη κλίνη» του ασθενούς, παραμένει στείρα. Το γεγονός αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη χαμηλή συγκέντρωση των μικροβιακών κυττάρων στο ασκιτικό υγρό (1 μικροοργανισμός ανά ml). Προκειμένου να διερευνηθεί ο αιτιολογικός μικροβιακός παράγοντας, παράλληλα με τη συμβατική καλλιέργεια έχουν χρησιμοποιηθεί μοριακές τεχνικές.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η δυνατότητα χρησιμοποίησης της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR στην ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας σε ασθενείς που νοσηλεύθηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Λάρισας, κατά το διάστημα 2008-2017.Εξετάστηκαν 150 ασκιτικά υγρά (111 πυλαίας υπέρτασης και 39 μη πυλαίας υπέρτασης), 32 από τα οποία χαρακτηρίστηκαν ως αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα σύμφωνα με τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. 10 ml ασκιτικού υγρού από κάθε ασθενή της μελέτης, ενοφθαλμίστηκαν σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών και άλλα 10 ml χρησιμοποιήθηκαν για την εφαρμογή ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR. Επιπλέον, η ίδια 16S rRNA PCR εφαρμόστηκε και στο υγρό της αιμοκαλλιέργειας που περιείχε το ασκιτικό υγρό, μετά την παρέλευση 14 ημερών επώασης. Στα δείγματα που η PCR έδωσε θετικό αποτελέσματα έγινε ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) προκειμένου να ταυτοποιηθεί ο μικροοργανισμός.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των καλλιεργειών, σε 4 από τις 32 περιπτώσεις αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας απομονώθηκε μικροοργανισμός (12.5%), ο οποίος ταυτοποιήθηκε ως Escherichia coli.H εφαρμογή της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR απευθείας στο ασκιτικό υγρό των πασχόντων, ανέδειξε τον ίδιο μικροοργανισμό με την καλλιέργεια, μόνο σε μία περίπτωση (ευαισθησία 25%, ειδικότητα 100%, θετική και αρνητική προγνωστική αξία 100% και 92.3% αντίστοιχα). Αναφορικά με τον χρόνο του αποτελέσματος, το αποτέλεσμα της PCR προηγήθηκε κατά 3 ημερών του αποτελέσματος της καλλιέργειας. Από την άλλη μεριά, η εφαρμογή της μοριακής μεθόδου στα υγρά των φιαλιδίων της αιμοκαλλιέργειας ταυτοποίησε γενετικό υλικό συγκεκριμένου μικροοργανισμού σε 5 περιπτώσεις. Εκτός από τις 4 θετικές αιμοκαλλιέργειες, όπου ταυτοποιήθηκε E. coli, ταυτοποίησε και μια επιπλέον περίπτωση από Brucella spp, η οποία δεν είχε ανιχνευθεί με την καλλιέργεια. Ο συγκεκριμένος ασθενής είχε θετική αιμοκαλλιέργεια από τον ίδιο μικροοργανισμό και πολύ υψηλό τίτλο Wright-Coombs.Συμπερασματικά η εφαρμογή της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR σε ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα απευθείας στο ασκιτικό υγρό, δε φαίνεται να είναι ιδιαίτερα βοηθητική. Αντίθετα η παράταση της επώασης των φιαλιδίων με το ασκιτικό υγρό από 5 ημέρες που είναι το σύνηθες, σε 14 ημέρες, βοηθά σημαντικά στην ανάδειξη του μικροοργανισμού. Η εφαρμογή της ευρέος φάσματος PCR σε όλα τα φιαλίδια που είναι αρνητικά μετά τον παρατεταμένο χρόνο επώασης βοηθά σημαντικά, ιδιαίτερα στην ανίχνευση απαιτητικών μικροοργανισμών.