Mελέτη της επίδρασης της μυκοτοξίνης ζεαραλενόνης στις αιματολογικές, βιοχημικές και ορμονικές παραμέτρους, την οξειδοαναγωγική κατάσταση του αίματος, καθώς και σε παραμέτρους εκτίμησης του σπέρματος αρσενικών κονίκλων

Abstract

Zearalenone (ZEN) is a non-steroid estrogenic mycotoxin produced by Fusarium spp moulds, which has been established as a reproductive toxicant for various species, while it also possesses haematotoxic, hepatotoxic, nephrotoxic, immunotoxic and prooxidant properties. The aim of the present study was to determine the effect of a low, naturally occurring concentration of ZEA (50μg/kg BW) on subchronically exposed rabbit bucks, in terms of their haematological, biochemical, redox status, and reproductive parameters. Ten clinically healthy adult bucks were assigned in the present study. Toxin solution was prepared by suspending purified ZEA into dimethyl sulfoxide (DMSO) up to the desired dose of 50μg/kg BW. The experimental period was equally allocated into a 7-week control and treatment period, respectively. During the control period, the animals were orally dosed with 0.5 ml of water and were sampled once weekly for blood and semen. During the treatment period, the animals were orally dosed with 0.5ml of DMSO/ZEA solution and were sampled in a similar manner. Complete blood counts were carried out on ADVIA 120 (Siemens Healthcare Diagnostics, USA), while Giemsa-stained smears were also examined. Sera samples were assayed in the analysers Flexor E (Vital Scientific NV, The Netherlands) and AVL 9180 Electrolyte Analyser (Roche Diagnostics, Belgium) for the concentration of the following analytes: total proteins, albumin, globulins, glucose, cholesterol, triglycerides, total calcium, inorganic phosphorus, potassium, sodium, urea, creatinine, ALP, ALT, AST, GGT and total bilirubin. Serum redox status was determined using d-ROMs test (Diacron Labs Srl, Italy). Serum testosterone concentration was measured on Immulite 1000 (Siemens Healthcare Diagnostics, USA). Semen samples were evaluated in terms of i) sperm kinetics using the Sperm Class Analyzer (Microptic SL, Spain], ii) sperm viability using calcein-propidium iodide double stain, iii) sperm morphology using Spermblue® stain, and iv) nuclear DNA integrity using acridine orange stain. At the end of the experiment, samples were obtained from liver, kidneys, adrenals, testes, and epididymides for histopathological examination. Statistical analysis was conducted with a repeated-measures mixed model. During the ZEA treatment period, the values of RDW, MPV, WBC, AST, total bilirubin, as well as monocyte and eosinophil counts were significantly increased compared to the control period, whereas a statistically significant decrease was observed in the concentrations of urea, creatinine, glucose, calcium, potassium, and sodium. In terms of the reproductive parameters, BCF values were significantly increased during the ZEA treatment period, as were the percentages of spermatozoa with head and midpiece abnormalities, and defective nuclear chromatin, when compared to the control period. Histopathological examination of liver and kidneys revealed vacuolar degeneration of hepatic and renal proximal tubular cells. In conclusion, under the present experimental conditions, ZEA induced several clinicopathological alterations in exposed rabbit bucks, which were suggestive of inflammation with a possible hypersensitivity component, mild hepatic damage and dysfunction and potential renal tubular damage and/or intestinal malabsorption. Concerning the reproductive system, ZEA seems to induce some mild alterations in reproductive parameters. Interestingly, the low concentration of ZEA did not seem to affect the bucks’ oxidative status by account of the selected biomarker.

Η ΖΕN είναι μια μη στεροειδής, οιστρογόνος μυκοτοξίνη, η οποία έχει καταγεγραμμένη τοξική δράση στο αναπαραγωγικό σύστημα, καθώς και αιματοτοξική, ηπατοτοξική, νεφροτοξική, ανοσοτοξική και προοξειδωτική δράση. Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η μελέτη της επίδρασης μιας χαμηλής δόσης ΖΕN (50μg/kg) χορηγούμενης μακροχρονίως στις αιματολογικές και βιοχημικές παραμέτρους, την οξειδοαναγωγική κατάσταση του αίματος, καθώς και το αναπαραγωγικό σύστημα αρσενικών κονίκλων. Δέκα αρσενικοί, κλινικά υγιείς ενήλικες κόνικλοι εντάχθηκαν στον πειραματικό πληθυσμό της μελέτης. Η παρασκευή του διαλύματος ΖΕΝ πραγματοποιήθηκε με τη διασπορά κονιορτοποιημένης μυκοτοξίνης σε διαλύτη διμεθυλο σουλφοξείδιο. Ο πειραματικός σχεδιασμός περιελάμβανε 7 εβδομάδες ελέγχου και 7 εβδομάδες χορήγησης τοξίνης. Κατά την περίοδο ελέγχου, οι κόνικλοι λάμβαναν καθημερινά per os 0,5 ml νερού, ενώ πραγματοποιούνταν λήψεις δειγμάτων αίματος και σπέρματος ανά εβδομάδα. Κατά την περίοδο χορήγησης, οι κόνικλοι λάμβαναν καθημερινά 0,5 ml διαλύματος τοξίνης, ενώ τα δείγματα αίματος και σπέρματος λαμβάνονταν κατά τον ίδιο τρόπο. Στα δείγματα ολικού αίματος πραγματοποιήθηκε γενική εξέταση (ADVIA 120, Siemens Healthcare Diagnostics, Η.Π.Α.) και κυτταρολογική εξέταση των επιχρισμάτων. Στα δείγματα ορών προσδιορίστηκε η συγκέντρωση των παρακάτω βιοχημικών παραμέτρων (Flexor E, Vital Scientific N.V., Ολλανδία· AVL 9180 Electrolyte Analyser, Roche Diagnostics, Βέλγιο): ολικές πρωτεΐνες, λευκωματίνη, σφαιρίνες, χολοστερόλη, τριγλυκερίδια, γλυκόζη, ολικό ασβέστιο, ανόργανος φωσφόρος, νάτριο, κάλιο, ουρία, κρεατινίνη, ALP, ALT, AST, γ-GT, και ολική χολερυθρίνη. Δείγματα ορών εξετάστηκαν για τη συγκέντρωση των δραστικών μεταβολιτών οξυγόνου (ROMs) (Diacron Labs S.r.l., Ιταλία) και τη συγκέντρωση βασικών επιπέδων τεστοστερόνης (Immulite 1000, Siemens Healthcare Diagnostics, Η.Π.Α.). Τα δείγματα σπέρματος εξετάστηκαν ως προς: i) τις κινητικές παραμέτρους των σπερματοζωαρίων με τη χρήση του Sperm Class Analyzer (Microptic S.L., Automatic Diagnostic Systems, Ισπανία), ii) τη ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων με την εφαρμογή διπλής φθορίζουσας χρώσης καλσεΐνης-ιωδιούχου προπιδίου, iii) τη μορφολογία των σπερματοζωαρίων με τη χρήση της χρωστικής Spermblue® και iv) την ακεραιότητα της πυρηνικής χρωματίνης με τη χρήση της φθορίζουσας χρωστικής πορτοκαλόχρωμης ακριδίνης. Με το πέρας του πειραματισμού, ελήφθησαν δείγματα ήπατος, νεφρών, επινεφριδίων, όρχεων και επιδιδυμίδων, προκειμένου να εξεταστούν ιστολογικά. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή ενός μικτού γραμμικού μοντέλου επαναλαμβανόμενων μετρήσεων. Κατά την περίοδο έκθεσης στη ΖΕΝ παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αύξηση των τιμών των παραμέτρων RDW, MPV, WBC, AST, της ολικής χολερυθρίνης, καθώς και των απόλυτων αριθμών των μονοκυττάρων και των εωσινοφίλων, ενώ αντιθέτως, οι συγκεντρώσεις της ουρίας, της κρεατινίνης, της γλυκόζης, του ολικού ασβεστίου, του καλίου και του νατρίου μειώθηκαν σημαντικά. Κατά την περίοδο έκθεσης στη ΖΕΝ, η παράμετρος BCF αυξήθηκε σημαντικά, καθώς και το ποσοστό των σπερματοζωαρίων με μορφολογικές ανωμαλίες κεφαλής και μέσου τμήματος, και το ποσοστό των σπερματοζωαρίων με διαταραχές ακεραιότητας της πυρηνικής χρωματίνης. Η ιστοπαθολογική εξέταση κατέδειξε την παρουσία κυτταροπλασματικής κενοτοπίωσης στα ηπατικά κύτταρα και τα επιθηλιακά κύτταρα των εγγύς νεφρικών ουροφόρων σωληναρίων. Συμπερασματικά, υπό τις παρούσες πειραματικές συνθήκες, η χορήγηση ΖΕΝ σχετίστηκε με την παρουσία φλεγμονώδους απόκρισης ή/και αντίδρασης υπερευαισθησίας, ήπιας ηπατοκυτταρικής βλάβης και ηπατικής δυσλειτουργίας, πιθανής νεφρικής βλάβης και/ή διαταραχής στην εντερική απορρόφηση. Αντιθέτως, οι περισσότερες παρατηρούμενες σημαντικές μεταβολές στις ποιοτικές παραμέτρους του σπέρματος θεωρούνται περιορισμένης βιολογικής σημασίας, καθώς με τα μέχρι σήμερα βιβλιογραφικά δεδομένα δεν αναμένεται να επηρεάσουν τη γονιμότητα των κονίκλων.