Λειτουργική ανάλυση του γονιδίου FRA10AC1 του ανθρώπου στο πλαίσιο του δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του σωματίου συναρμογής

Abstract

The FRA10AC1 gene is mapped in the rare fragile site FRA10A, which is induced in the absence of folic acid in the cell culture medium, in the human chromosomal region 10q23.3. FRA10A is the most prevalent among the rare folate-sensitive autosomal fragile sites in the human genome, and its expression is estimated about 1 in 500 individuals. FRA10A carriers exhibit mental and developmental disabilities, such as dysmorphic features, short stature, hypospadias and speech difficulty. The molecular basis of its cytogenetic expression is the expansion (~200 repeat units) of trinucleotide repeats of the type (CGG)n which are located in the 5’ untranslated region of the FRA10AC1 gene. The expansion results in hypermethylation of this region results in and the transcriptional repression of the corresponding allele. The FRA10AC1 gene is transcriptionally active in all adult tissues, exhibiting higher levels of expression in organs with high transcriptional activity such as brain, heart, skeletal muscles and liver. The major transcript of the FRA10AC1 gene encodes a protein of 315aa, which exhibits exclusively nuclear topology. FRA10AC1 is a conserved protein as it presents orthologs in a number of eukaryotic, multicellular or unicellular organisms, but not in prokaryotic organisms. The FRA10AC1 protein has been repeatedly identified as a component of the major spliceosome and its subcomplexes, B act (activated), C and P. Also, genetic experiments in Chlamydomonas reinhardtii indicate that FRA10AC1 contributes in splice site recognition, and, its protein-protein interactions with spliceosomal components (DGCR14, SF3B2) were identified by different biochemical methods. Based on the data mentioned above, it is indicated that FRA10AC1 involves in mRNA processing. To understand the functional role of FRA10AC1, in a first place, its protein-protein interaction network was constructed, and, then, the protein-protein interaction network of whole spliceosome. PICKLE meta-database, DroID and Worm Interactome Database, which include protein-protein interaction data in human and in model organisms, D. melanogaster and C. elegans, respectively, were used for network reconstruction. Only direct protein-protein interactions were retrieved from these databases. A key criterion for the integration of one interaction in the protein-protein interaction network of spliceosome was the biochemical identification of proteins as components of the spliceosome and its subcomplexes. The analysis of the network topological parameters performed by computational methods, and gene ontology analysis of the FRA10AC1 broader 'neighborhood' within the spliceosome network contributed to imply possible biological function of FRA10AC1. At the same time, a HeLa cell model with stable suppressed expression of the FRA10AC1 gene was developed, through the use of shRNA clones which target the coding region of the endogenous FRA10AC1 gene. In this cell model, omic approaches were applied on three basic levels of cellular function (transcriptomics, proteomics, metabolomics) in order to investigate the effects of suppression of FRA10AC1 gene expression in cell physiology. The study of these changes in the context of the protein-protein interactions of the spliceosome, but also beyond this context, also contributed to the construction of proposed FRA10AC1 functional models within spliceosome.

Το γονίδιο FRA10AC1 εντοπίζεται στην σπάνια εύθραυστη χρωμοσωματική θέση FRA10A, η οποία επάγεται απουσία φυλλικού οξέος στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων, στην χρωμοσωματική περιοχή 10q23.3 του ανθρώπου. Η FRA10A αποτελεί την πιο συχνά εμφανιζόμενη σπάνια εύθραυστη θέση στο γονιδίωμα του ανθρώπου με συχνότητα που εκτιμάται στους 1/500. Οι φορείς της FRA10Α εμφανίζουν νοητική και αναπτυξιακή υστέρηση, όπως δυσμορφικά χαρακτηριστικά, μικρό ανάστημα, υποσπαδία και δυσχέρεια λόγου. Η μοριακή βάση της κυτταρογενετικής εμφάνισής της είναι η επέκταση, κατά τουλάχιστον ~200 φορές, τρινουκλεοτιδικών επαναλήψεων του τύπου (CGG)n που εντοπίζονται στην 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή του γονιδίου FRA10AC1. Αυτή η επέκταση οδηγεί στην υπερμεθυλίωση της περιοχής αυτής και στη μεταγραφική καταστολή του αντίστοιχου αλληλομόρφου. Το γονίδιο FRA10AC1 είναι μεταγραφικά ενεργό σε όλους τους ιστούς ενήλικων ατόμων παρουσιάζοντας υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στον εγκέφαλο, την καρδιά, τους σκελετικούς μύες και το ήπαρ. Το κύριο μετάγραφο του γονιδίου FRA10AC1 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 315 αμινοξέων που εμφανίζει αποκλειστικά πυρηνική τοπολογία. Η FRA10AC1 είναι μια συντηρημένη πρωτεΐνη καθώς εμφανίζει ορθόλογα μόρια σε πλήθος ευκαρυωτικών, πολυκύτταρων ή μονοκύτταρων οργανισμών, αλλά όχι σε προκαρυωτικούς οργανισμούς. Έχει ταυτοποιηθεί επανειλημμένα ως συστατικό του μείζονος σωματίου συναρμογής και των επιμέρους υποσυμπλόκων του, B act (activated), C και P. Επίσης, έχει δειχθεί, με γενετικά πειράματα στο φύκος Chlamydomonas reinhardtii, ότι συνεισφέρει στην αναγνώριση των θέσεων συναρμογής, και με διαφορετικές πειραματικές μεθόδους, ότι αλληλεπιδρά με συστατικά του σωματίου συναρμογής (DGCR14, SF3B2). Βάσει των παραπάνω υποδεικνύεται η συμμετοχή της στις διαδικασίες επεξεργασίας του mRNA. Με στόχο την κατανόηση του λειτουργικού ρόλου της FRA10AC1 έγινε, αρχικά, η ανασύσταση του δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της και, ακολούθως, ολόκληρου του σωματίου συναρμογής. Για την ανακατασκευή των δικτύων χρησιμοποιήθηκε η μεταβάση PICKLE η οποία περιλαμβάνει καταχωρήσεις από πέντε βάσεις δεδομένων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του ανθρώπου, καθώς και οι βάσεις δεδομένων DroID και Worm Interactome Database που περιλαμβάνουν πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις από τους οργανισμούς-μοντέλα, D. melanogaster και C. elegans. Πραγματοποιήθηκε η ανάκτηση των δεδομένων που αφορούσαν μόνο άμεσες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις με βασικό κριτήριο, στην περίπτωση του δικτύου του σωματίου συναρμογής, τη βιοχημική ταυτοποίηση των πρωτεϊνών ως συστατικά του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού αυτού συμπλόκου. Η ανάλυση των τοπολογικών παραμέτρων του δικτύου του σωματίου συναρμογής και της γονιδιακής οντολογίας της ευρύτερης «γειτονιάς» της FRA10AC1 συνεισέφερε στην εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με την πιθανή βιολογική λειτουργία της FRA10AC1. Παράλληλα, δημιουργήθηκε ένα κυτταρικό μοντέλο HeLa με μόνιμα κατεσταλμένη την έκφραση του γονιδίου FRA10AC1, μέσω της χρήσης κλώνων shRNA που στοχεύουν στη κωδική περιοχή του ενδογενούς γονιδίου. Στο κυτταρικό μοντέλο εφαρμόστηκαν ομικές προσεγγίσεις στα τρία βασικά επίπεδα κυτταρικής λειτουργίας (μεταγραφικό, πρωτεϊνικό, μεταβολικό) ώστε να ελεγχθούν οι επιδράσεις που προκαλούσε η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου στην κυτταρική φυσιολογία. Η μελέτη των αλλαγών αυτών στο πλαίσιο του δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του σωματίου συναρμογής αλλά και εκτός αυτού συνεισέφερε στην ανάπτυξη προτεινόμενων μοντέλων λειτουργίας της FRA10AC1 εντός του σωματίου συναρμογής.