Μεθυλίωση των T-UCRs (Transcribed-Ultra Conserved Regions) σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου

Abstract

Colorectal cancer is the second leading cause of cancer related deaths for men and third for women worldwide. Although screening through colonoscopy has attributed to decline of cancer mortality, patients do not comply with the examination. Screening through analysis of circulating DNA and especially genetic and epinetic changes provide a minimally invasive method. Transcribed-Ultraconserved Regions (T-UCRs) are genomic regions longer than 200 bp, which are highly conserved among human, mouse and rat genomes. Their transcription is often deregulated in many cancer types and is regulated by epigenetic mechanisms.The aim of this study was the assession of expression and methylation levels of T-UCRs 160, 283 and 346 in colorectal adenocarcinomas and adjacent non neoplastic tissues, the investigation of their role in colorectal cancer progression and the possible diagnostic value of methylated T-UCRs in plasma or urine for colorectal cancer or adenoma detection.T-UCRs expression levels were assessed in cancer and adjacent non neoplastic tissues from 51 patients with colorectal cancer, with non neoplastic tissues having higher levels of Uc160 (p<0.001). T-UCRs methylation levels were assessed in cancer and adjacent non neoplastic tissues from 64 patients with colorectal cancer, as well as in 6 adenomas, with cancer tissues having higher methylation levels of all three T-UCRs (p<0.001, p=0.001 and p=0.004). Moreover, T-UCRs methylation levels seemed to have a prognostic value in specific subgroups of patients. More specifically, low methylation levels of Uc160 or high methylation levels of Uc283 were associated with longer time to disease progression for patients older than 66 yearls old (p=0.005 and p=0.050 respectively). In patients with positive lymph nodes, high methylation levels of Uc346 were associated with longer 5-year survival (p=0.016).T-UCRs methylation levels were also assessed in plasma samples from 50 colorectal cancer patients, 59 adenoma patients, 12 patients with bowel inflammation and 40 healthy volunteers and were associated with colorectal cancer or adenoma existence. Uc160 and Uc346 methylation levels differed significantly in the plasma samples of the four groups, with cancer patients having the highest levels (p<0.001 and p=0.039 respectively). Furhter investigating their diagnostic value, methylation of Uc160 and the combination of methylated T-UCRs were found to have the best sensitivity and specificity values for colorectal cancer (35% and 89% for Uc160, p=0.016 and 45% and 74.3% for all T-UCRs, p=0.013, respectively), while their diagnostic value for adenomas was low. The same analyses were performed in urine samples from 24 colorectal cancer patients, 26 adenoma patients, 10 patients with bowel inflammation, and 26 healthy volunteers, without a diagnostic value of T-UCRs for colorectal cancer or adenoma being revealed.Furthermore, the functional role of Uc160 and Uc346 were assessed in colon cancer cells. Uc160 and Uc346 were overexpressed in colon cancer cell lines Caco-2, DLD-1 and HT-29, and proliferation, motility and migration rates were assessed. Proliferation rates were higher in cells overexpressing Uc160 or Uc346 in all cell lines and all different time points studied (24h και 48h) (p=0.050 and p=0.002 respectively in Caco-2 cells in 24 h). Increased rates were also observed in motility of all cell lines in all differents time points in cells overexpressing Uc160 or Uc346 (p=0.017 and p=0.041, in 24 h and p=0.042 and p=0.043, in 48h in DLD-1 cells). Moreover, more DLD-1 cells overexpressing Uc160 or Uc346 migrated compared to control cells (p=0.005 for both T-UCRs).In conclusion, in the present study we showed that T-UCRs 160, 283 and 346 expression and methylation are deregulated in colorectal cancer, while Uc160 and Uc346 affect proliferation and migration rates of the cells. Furthermore, their methylation have prognostic value and is a minimally invasive test for colorectal cancer detection, provided that the sensitivity of the method will be improved.

Ο κολοορθικός καρκίνος αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου σχετιζόμενου με καρκίνο στους άνδρες και την τρίτη στις γυναίκες παγκοσμίως. Παρόλο που ο έλεγχος με κολονοσκόπηση έχει συμβάλει στη μείωση της θνητότητας, η συμμόρφωση στις οδηγίες προληπτικού ελέγχου παραμένει πολύ χαμηλή. Λιγότερο επεμβατικό τρόπο αποτελεί η μελέτη του κυκλοφορούντος DNA και η ανεύρεση κατάλληλων βιοδεικτών, μεταξύ των οποίων συχνότεροι είναι αυτοί που σχετίζονται με γενετικές και επιγενετικές αλλαγές. Οι μεταγραφόμενες υπερσυντηρημένες περιοχές (Transcribed-Ultraconserved Regions, T-UCRs) είναι περιοχές του γονιδιώματος, οι οποίες είναι μεγαλύτερες των 200 bp και είναι απόλυτα συντηρημένες ανάμεσα στον άνθρωπο, τον μυ και τον επίμυ. Συχνά, η έκφρασή τους είναι απορρυθμισμένη σε διάφορους τύπους καρκίνου και ρυθμίζεται από επιγενετικούς μηχανισμούς.Αντικείμενο της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης και της μεθυλίωσης των T-UCRs 160, 283 και 346 σε αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου και ορθού, όπως επίσης και σε παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς, καθώς και η διερεύνηση του ρόλου τους στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επίσης, εκτιμήθηκε η πιθανή διαγνωστική αξία της μεθυλίωσης των T-UCRs στο πλάσμα και στα ούρα για τον κολοορθικό καρκίνο και τα αδενώματα του παχέος εντέρου.Τα επίπεδα έκφρασης των T-UCRs προσδιορίστηκαν σε καρκινικούς και παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς 51 ασθενών, με τη Uc160 να εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα στους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς (p<0,001). Τα επίπεδα μεθυλίωσης των T-UCRs προσδιορίστηκαν επίσης σε καρκινικούς και παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς 64 ασθενών, καθώς επίσης και σε 6 αδενώματα, με τους καρκινικούς ιστούς να έχουν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης των τριών T-UCRs, σε σχέση με τους παρακείμενους μη νεοπλασματικούς ιστούς (p<0,001, p=0,001 και p=0,004). Επιπλέον, αναδείχθηκε η προγνωστική αξία των επιπέδων μεθυλίωσης των T-UCRs στους καρκινικούς ιστούς σε συγκεκριμένες ομάδες ασθενών. Πιο συγκεκριμένα, τα χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc160 ή τα υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc283 συσχετίστηκαν με μεγαλύτερο διάστημα υποτροπής της νόσου των ασθενών άνω των 66 ετών (p=0,005 και p=0,050 αντίστοιχα). Σε ασθενείς, που είχαν διήθηση των επιχώριων λεμφαδένων, τα υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης της Uc346 συσχετίστηκαν με μεγαλύτερη πενταετή επιβίωση (p=0,016).Τα επίπεδα μεθυλίωσης των T-UCRs προσδιορίστηκαν επίσης στο πλάσμα 50 ασθενών με κολοορθικό καρκίνο, 59 ασθενών με αδένωμα, 12 ασθενών με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και 40 υγιών ατόμων και στη συνέχεια διερευνήθηκε η διαγνωστική τους αξία. Τα επίπεδα μεθυλίωσης των Uc160 και Uc346 στο πλάσμα διέφεραν ανάμεσα στις τέσσερις ομάδες, με τους ασθενείς με καρκίνο να έχουν τα υψηλότερα επίπεδα (p<0,001 και p=0,039 αντίστοιχα). Διερευνώντας την πιθανή διαγνωστική τους αξία, βρέθηκε ότι η μεθυλίωση της Uc160 και ο συνδυασμός των τριών μεθυλιωμένων T-UCRs είχαν τις μεγαλύτερες τιμές ευαισθησίας και ειδικότητας (35% και 89% για τη Uc160, p=0,016 και 45% και 74,3% για τις τρεις T-UCRs, p=0,013 αντίστοιχα) για τον κολοορθικό καρκίνο, ενώ για το αδένωμα οι μεθυλιωμένες T-UCRs είχαν χαμηλή διαγνωστική αξία. Οι ίδιες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ούρα από 24 ασθενείς με κολοορθικό καρκίνο, 26 ασθενείς με αδένωμα, 10 ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και 26 υγιή άτομα, χωρίς ωστόσο να αναδειχθεί διαγνωστική αξία των T-UCRs για τον κολοορθικό καρκίνο ή τα αδενώματα.Εν συνεχεία, διερευνήθηκε η λειτουργική σημασία της έκφρασης των ανωτέρω T-UCRs στις καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου Caco-2, DLD-1 και HT-29. Αρχικά, οι Uc160 και Uc346 υπερεκφράστηκαν και προσδιορίστηκε ο ρυθμός πολλαπλασιασμού, μετακίνησης και μετανάστευσης. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν και σε όλες τις χρονικές στιγμές (24h και 48h), οι ρυθμοί πολλαπλασιασμού ήταν υψηλότεροι στα κύτταρα, τα οποία υπερεξέφραζαν τις Uc160 ή Uc346 (p=0,050 και p=0,002 αντίστοιχα για τα Caco-2 κύτταρα στις 24 h). Αυξημένοι ρυθμοί παρατηρήθηκαν επίσης και στη μετακίνηση σε όλες τις κυτταρικές σειρές και σε όλες τις χρονικές στιγμές, στα κύτταρα που υπερεξέφραζαν τις Uc160 ή Uc346 (p=0,017 και p=0,041, στις 24 h και p=0,042 και p=0,043, στις 48h για τα DLD-1). Επιπλέον, περισσότερα κύτταρα DLD-1, τα οποία υπερεξέφραζαν τις Uc160 ή Uc346 μετανάστευσαν σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρες (p=0,005 και για τις δύο T-UCRs).Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη δείξαμε, αφενός μεν, πως η έκφραση και η μεθυλίωση των T-UCRs Uc160, Uc283 και Uc346 στον κολοορθικό καρκίνο είναι απορρυθμισμένες, αφετέρου δε, πως επηρεάζουν θεμελιώδη χαρακτηριστικά του καρκινικού κυττάρου, όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, η μετακίνηση και η μετανάστευση. Τέλος, βρέθηκε πως η μεθυλίωσή τους έχει προγνωστική αξία και αποτελεί μία υποσχόμενη ελάχιστα επεμβατική δοκιμασία για την ανίχνευση του κολοορθικού καρκίνου, η οποία όμως χρήζει περαιτέρω διερεύνησης και βελτίωσης.