Ο ρόλος των μεταγραφικών μηχανισμών και της επιγενετικής στην ανθρώπινη παθογένεια

Abstract

The goal of this thesis is the interlink of the DNA damage repair pathways with active transcription. We focus on the role of transcription in safeguarding the integrity of the genomic information in cases of DNA damage both in normal cell lines and cell lines from human diseases. The ultimate goal is to understand on the molecular level the disease phenotype as it is demonstrated in inherited genetic disorders and premature aging syndromes.Here we show our results from two independent projects, although both explore the mechanisms of DNA damage repair and homeostasis. In the first project we explore the role of transcription stalling in the disease spinocerebellar ataxia with axonal neuropathy (SCAN1) and the implication of tyrosyl-phosphodiesterase1 (TDP1) in molecular events. The TDP1 protein is a DNA damage repair (DDR) enzyme implicated in the repair of complexes that are composed from topoisomerase I bound to DNA called topoisomerase I cleavable complexes (TopIcc). When they persist due to DNA damage or the presence of specific drugs such as camptothecin (CPT) they cause physical barrier for processes that require open chromatin conformation, such as replication and transcription. The affected cells in SCAN1 are terminally differentiated non dividing neuronal cells of the cerebellum, thus it is assumed that the phenotype of the disease originates from the impairment of the transcription machinery. Our approach focuses on next generation sequencing (NGS) methods with the scope of gaining in depth understanding of the events that occur in chromatin level in SCAN1 disease and in impairment of TDP1.For the second project we focused on the FACT complex.To study chromatin remodeling during DNA repair, we established quantitative fluorescence imaging methods to measure the exchange of histones in chromatin in living cells. We show that particularly H2A and H2B are evicted and replaced at an accelerated pace at sites of UV- induced DNA damage. This accelerated exchange of H2A/H2B is facilitated by SPT16, one of the two subunits of the histone chaperone FACT (facilitates chromatin transcription) but largely independent of its partner SSRP1. Interestingly, SPT16 is targeted to sites of UV light-induced DNA damage-arrested transcription and is required for efficient restart of RNA synthesis upon damage removal. Together, our data uncover an important role for chromatin dynamics at the crossroads of transcription and the UV-induced DNA damage response.

Σκοπός της διατριβής αυτής είναι η διασύνδεση των επιδιορθωτικών μηχανισμών του κυττάρου με τη λειτουργία της μεταγραφής. Εστιάζουμε στη μελέτη του ρόλου της μεταγραφής στη διασφάλιση της πιστότητας της γενετικής πληροφορίας σε περιπτώσεις βλαβών στο DNA τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Απώτερος σκοπός μας είναι η κατανόηση σε μοριακό επίπεδο της κλινικής εικόνας όπως απεικονίζεται σε σοβαρές εγγενείς διαταραχές και σύνδρομα πρόωρης γήρανσης.Στις επόμενες σελίδες θα παρουσιαστούν δυο εγχειρήματα τα οποία εκπονήθηκαν στα πλαίσια της διατριβής αυτής και που εστίασαν σε μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA μετά από επαγωγή βλαβών. Και για τα δυο κοινός σκοπός είναι η μελέτη και αποσαφήνιση των μηχανισμών που είναι υπεύθυνοι για την επιδιόρθωση βλαβών στο DNA και τη διατήρηση της ομοιόστασης του κυττάρου.Στο πρώτο εγχείρημα, επικεντρωθήκαμε στον ρόλο της πρωτεΐνης TOP1, τοποϊσομεράσης I, στη ρύθμιση της μεταγραφής κάνοντας χρήση του χημικού CPT, καμπτοθεσίνη, το οποίο δεν επιτρέπει την απελευθέρωση της TOP1 από το DNA αφού επιτελέσει το ρόλο της. Η δημιουργία συμπλόκων TOP1cc με το DNA αποτελεί φυσικό εμπόδιο για τις κυτταρικές λειτουργίες της αντιγραφής και της μεταγραφής. Επίσης, ο ρόλος της TOP1 μελετήθηκε και σε κύτταρα ασθενών SCAN1 με μεταλλαγμένη κ μη λειτουργική TDP1 πρωτεϊνη, τυροσινική φωσφοδιεστεράση, η οποία αποτελεί μέρος του μηχανισμού απομάκρυνσης των TOP1cc. Στo δεύτερο εγχείρημα εστιάσαμε στον παράγοντα FACT (FAcilitates Chromatin Transcription) και στον ρόλο του στην επανάκαμψη της μεταγραφής μετά από βλάβη που έχει προκληθεί από υπεριώδη (UltraViolet- UV) ακτινοβολία.