Μελέτη της δομικής και λειτουργικής αλληλεπίδρασης πυρηνικών πρωτεϊνών κάτω από υποξία και άλλες στρεσογόνες συνθήκες

Abstract

SAFB1 (Scaffold Attachment Factor) is a nuclear matrix protein isolated approximately twenty years ago, based on its ability to bind to scaffold/matrix attachment regions (S/MARs) on DNA. SAFB1 shares 74% homology with SAFB2, its closest evolutionary relative. The two proteins are the subject of the present thesis. Their structural domains consist of a Scaffold Attachment Factor-box (SAF-box) that interacts with S/MARs at the N-terminus, a RNA-Recognition Motif (RRM), and a glutamic acid/arginine-rich (RE) and glycine/arginine-rich (RG) region at the C-terminus that are responsible for most of their known protein-protein interactions. The first part of this thesis concerns the investigation of the ability of SAFBs to bind to chromatin, (due to their N-terminal region) under the effect of two metabolic stress conditions, hypoxia and glucose deprivation. For each condition, the protein levels as well as their sub-cellular localization were studied. The results show that neither glucose deprivation nor hypoxia alter their sub-cellular localization but affect SAFB1 and SAFB2 protein levels. More specifically, SAFB1 and SAFB2 expression levels significantly increased under hypoxia. This induction is not transcriptional and is independent of the major mediators of the hypoxic response, the HIF (Hypoxia-inducible factor) proteins. It seems that the increase happens due to the translocation of SAFB1/2 from the chromatin-bound fraction to the nucleoplasm. Moreover, hypoxia does not affect the SAFB1/2 co-repressor activity on ERα. On the contrary, glucose deprivation decreases the expression levels of SAFB1/2, but it is not clear whether this change happens at the transcriptional level. The second part of the thesis concerns the investigation of SAFB function through two interactions which have been discovered in the laboratory of Biochemistry and both take place at the distal C-terminal RG-rich region of SAFB. The first interaction is between SAFB and Serine Arginine Protein Kinase 1 (SRPK1). First, the interaction of SAFB1 with SRPK1 was examined structurally. Using in vitro binding assays, it was found that SRPK1 interacts with SAFB1/2 via its C-terminal domain (473-655). Since SRPK1 is mostly cytoplasmic whereas SAFB is nuclear, we investigated the conditions under which both proteins might reside in the nucleus. The protein levels as well as the sub-cellular localization of SRPK1 were studied under hypoxia, osmotic stress, amino acid deprivation and glucose deprivation. None of these conditions altered the protein levels of SRPK1. However, under osmotic stress and glucose deprivation, a low range reorganization and translocation of SRPK1 in discrete nuclear structures was detected. The second interaction that was scrutinized was between SAFB and ERH, a protein involved in multiple basic cellular mechanisms, including splicing. Immunoprecipitation experiments and pull down assays show that ERH interacts directly with the C-terminal RG rich region of SAFB1/2 in the nucleus. Immunofluorescence experiments and subcellular fractionation revealed that SAFB-ERH co-localizes in the insoluble nuclear fraction. Finally, functional analyses suggests that the SAFB/ERH interaction does not affect SAFB1/2 function in transcription (as Estrogen Receptor α (ERα) co-repressors) but reverses the inhibition exerted by SAFB1/2 on SRPK1 activity, a consequence of SRPK1 and ERH binding on a common domain on SAFB1/2. Overall, this study provides a better understanding of the functions of SAFB1 and SAFB2, since these proteins and their partners are involved in basic cellular activities such as chromatin organization, RNA metabolism and transcription.

O παράγοντας SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B) είναι πρωτεΐνη της πυρηνικής μήτρας και απομονώθηκε πριν από είκοσι περίπου χρόνια με βάση το χαρακτηριστικό του να προσδένεται σε στοιχεία S/MAR (Scaffold/Matrix Attachment Region) του DNA. Ο SAFB1 με τον εξελικτικά συγγενή του SAFB2, έχουν μεταξύ τους ομολογία 74% και αποτελούν αντικείμενο έρευνας της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Αποτελούνται από την περιοχή πρόσδεσης στο DNA, SAF-box στο αμινοτελικό τους άκρο, την περιοχή δέσμευσης με το RNA, RRM, ενώ στο καρβοξυτελικό τους άκρο έχουν μια περιοχή πλούσια σε επαναλήψεις Arg-Glu (R/E) που ακολουθείται από μια περιοχή πλούσια σε κατάλοιπα Arg και Gly (R, G), υπεύθυνη για τις γνωστές ως τώρα πρωτεϊνικές τους αλληλεπιδράσεις. Στο πρώτο μέρος της διατριβής εξετάστηκε η ικανότητα πρόσδεσης των SAFB στη χρωματίνη μέσω της αμινοτελικής τους περιοχής, υπό την επίδραση δυο μεταβολικών στρεσσογόνων συνθηκών, της υποξίας και της στέρησης γλυκόζης. Για κάθε συνθήκη εξετάστηκαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα και ο υποκυτταρικός εντοπισμός τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο συνθήκες δεν επηρεάζουν τον υποκυτταρικό εντοπισμό τους αλλά τα πρωτεϊνικά επίπεδά τους. Συγκεκριμένα, η υποξία αυξάνει τα πρωτεϊνικά επίπεδα των SAFB1/2 όχι όμως στο επίπεδο της μεταγραφής και με μηχανισμό ανεξάρτητο των μεταγραφικών παραγόντων HIFs (Hypoxia-inducible factors), αλλά προκαλώντας αύξηση του διαλυτού κλάσματός τους στο πυρηνόπλασμα. Επίσης η υποξία δεν επηρέασε την δράση τους ως συγκαταστολείς της μεταγραφικής ενεργότητας του ERα (Estrogen Receptor α). Αντίθετα, η στέρηση γλυκόζης φάνηκε να μειώνει τα πρωτεϊνικά επίπεδα των SAFB1/2, χωρίς όμως να αποκλείεται αυτό να συμβαίνει στο επίπεδο της μεταγραφής.Στο δεύτερο μέρος διερευνήθηκαν οι λειτουργίες των SAFB μέσω δύο αλληλεπιδράσεων που έχουν βρεθεί στο εργαστήριο Βιοχημείας και συμβαίνουν με το καρβοξυτελικό τους άκρο. Η πρώτη αλληλεπίδραση είναι με την κινάση SRPK1 (Serine/Arginine Protein Kinase 1). Καταρχάς εξετάστηκε δομικά, όπου με πειράματα χρωματογραφίας αγχιστείας εντοπίστηκε για πρώτη φορά, ότι τα 180 C-τελικά αμινοξέα της SRPK1(473-655) είναι ικανά και απαραίτητα για την αλληλεπίδραση της με τον SAFB1. Επίσης, διερευνήθηκε λειτουργικά, μέσω εύρεσης συνθηκών όπου τα δύο μόρια SAFB και SRPK1, τα οποία κατά τ’ άλλα έχουν διαφορετικές υποκυτταρικές κατανομές, είναι πιθανόν να βρεθούν σε κοινό υποκυτταρικό εντοπισμό. Εξετάστηκαν τα πρωτεϊνικά επίπεδα και ο υποκυτταρικός εντοπισμός της SRPK1 υπό την επίδραση της υποξίας, του οσμωτικού στρες, της στέρησης αμινοξέων και της στέρησης γλυκόζης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι καμία από τις τέσσερις συνθήκες δεν ήταν ικανή να μεταβάλλει τα πρωτεϊνικά επίπεδα της SRPK1, ενώ μόνο οι συνθήκες του οσμωτικού στρες και της στέρησης γλυκόζης προκάλεσαν μια υποκυτταρική μετατόπιση της SRPK1, σε διακριτές πυρηνικές δομές. Η δεύτερη αλληλεπίδραση που εξετάστηκε ήταν με την πρωτεΐνη ERH (Enhancer of Rudimentary Homologue), η οποία εμπλέκεται σε ποικίλες βασικές κυτταρικές διεργασίες μεταξύ των οποίων και το μάτισμα. Με πειράματα ανοσοκατακρήμινσης και χρωματογραφίας αγχιστείας βρέθηκε ότι η ERH αλληλεπιδρά άμεσα μέσα σε κύτταρα θηλαστικών μέσω των 205 καρβοξυτελικών αμινοξικών καταλοίπων των SAFB, ενώ από πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικής κλασμάτωσης δείχθηκε ότι οι δυο πρωτεΐνες συν-εντοπίζονται στην πυρηνική μήτρα. Τέλος, η ERH δεν μεταβάλλει τη λειτουργία των SAFB1/2 ως συγκαταστολείς του υποδοχέα των οιστρογόνων ERα αλλά αναιρεί την καταστολή που προκαλούν στην ενζυμική δράση της SRPK1, λογικό επακόλουθο του γεγονότος ότι SRPK1και ERH προσδένονται στην ίδια επικράτεια των SAFB1/2.Συνολικά τα παραπάνω ευρήματα θα βοηθήσουν στην εμβάθυνση και την κατανόηση των λειτουργιών των SAFB1/2 και των μοριακών παρτενέρ τους, οι οποίοι εμπλέκονται σε βασικές κυτταρικές διεργασίες όπως είναι η οργάνωση της χρωματίνης, ο μεταβολισμός του RNA και η μεταγραφή.