Λειτουργική έκφραση και επαγωγή των ενδοκυττάριων αυτοαντιγόνων στην αυτοανοσία

Abstract

In the present study we investigated the regulation and induction of intracellular autoantigens in autoimmunity. Initially we investigated the potential of humoral responses to 'jump' from one ribonucleoprotein complex to another. For this purpose we immunized NZW rabbits with a peptide corresponding to the epitope 145–164 of La/SSB that belongs to the RNA Recognition Motif (RRM) of the protein. The antibodies produced by the immunized rabbits recognized the immunization peptide, the autoantigen La/SSB and U1-RNP, as attested by immunoblotting and ELISA. Removal of antibodies against peptide 145-164 using immunoaffinity columns resulted in the loss of anti-U1-RNP activity of sera from immunized rabbits, but not human sera (20 SLE patients, anti–U1-RNP+). These findings suggest that the RRM of La/SSB can trigger interparticle spreading of humoral responses to U1-RNP-70 by molecular mimicry. The anti-Ro/SSA and anti-La/SSB autoantibodies in sera of pregnant women that are transported to the fetus through the placenta have been implicated in the development of neonatal lupus in fetuses. On the other hand, production of a network of Id/anti-Id antibodies has been shown to protect the fetus. Prophylactic administration of intravenous immunoglobulin (IVIG) in anti-Ro/La+ pregnant women was found to significantly alter the Id/anti-Id network of anti-La/SSB autoantibodies. Moreover, the ratio of Id:anti-Id antibodies was statistically significantly lower in pregnant women who gave birth to a healthy child than in women who gave birth to a child with neonatal lupus.Finally, we studied the effect of TLR3 stimulation on the production of intracellular Ro52/TRIM21, Ro60/TROVE2 and La/SSB autoantigens in salivary gland epithelial cells (SGECs) of Sjögren syndrome patients. Treatment of cells with the TLR3 ligand analogue, polyI:C, but not with TLR4 ligand, LPS, induces the expression of Ro52/TRIM21-mRNA from SGECs in a two step fashion, one at 6-hours (12-fold increment) and a late at 24-48-hours (an additional 2.5-fold increment). Furthermore, polyI:C treatment increases the expression of Ro60/TROVE2 and La/SSB mRNAs (2.5-fold) at 48-hours. The expression levels of Ro52/TRIM21, Ro60/TROVE2 and La / SSB proteins were not significantly affected. However, treatment with polyI:C (48-72-hours), but not LPS, resulted in a redistribution of Ro52/TRIM21 protein in the nucleus of SGECs, from nucleolar staining to multiple coarse dots spanning throughout the nucleus. Expression of autoantigens in HeLa cells (neoplastic epithelial cell line-control) was not affected by either polyI:C or LPS treatment. Levels of secreted interferons and inhibition experiments strongly suggest that the late increment of Ro52/TRIM21-mRNA and redistribution of protein in SGECs is partially mediated by IFNβ production, but not IFNα or IFNγ. These findings suggest that innate immunity pathways may be involved in the induction and presentation of autoantigens to the immune system.The findings of the present Thesis that are presented for the first time are:1.The mechanism that could explain interparticle spreading of epitopes2.The regulatory effect of IVIG on idiotype/anti-idiotype network of pathogenic antibodies.3.TLR3-mediated regulation of the expression of intracellular autoantigens.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ρύθμιση και επαγωγή των ενδοκυττάριων αντιγόνων στην αυτοανοσία. Αρχικά διερευνήθηκε η δυνατότητα των χυμικών αποκρίσεων να «μεταπηδούν» από ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο σε άλλο. Ανοσοποιήθηκαν κουνέλια NZW με ένα πεπτίδιο που αντιστοιχεί στον επίτοπο 145–164 του μοτίβου αναγνώρισης RNA (ΜΑR) της πρωτεΐνης La/SSB. Τα αντισώματα των ανοσοποιημένων κουνελιών, όπως αποδείχθηκε με ανοσοαποτύπωση και ELISA αναγνώριζαν το πεπτίδιο-ανοσοποίησης, το αυτοαντιγόνο La/SSB και το αυτοαντιγόνο U1-RNP. Η απαλοιφή των αντισωμάτων έναντι του πεπτιδίου 145-164 με τη χρήση στήλης ανοσοσυγγένειας οδήγησε στην εξάλειψη της αντί-U1-RNP δραστικότητας των ορών από ανοσοποιημένα κουνέλια, αλλά όχι στους ανθρώπινους ορούς (20 ασθενείς με ΣΕΛ, αντί–U1-RNP+). Φαίνεται, λοιπόν, ότι η περιοχή ΜΑR της La/SSB μπορεί να πυροδοτήσει διασωματιακή διαφοροποίηση της B-κυτταρικής απόκρισης στην U1-RNP-70 μέσω μοριακής μίμησης.Τα αντί-Ro/SSA και αντί-La/SSB αυτοαντισώματα στον ορό της εγκύου μητέρας και η μεταφορά τους μέσω του πλακούντα στο έμβρυο εμπλέκονται στην ανάπτυξη νεογνικού λύκου στα έμβρυα, ενώ η δημιουργία δικτύου Ιδ/αντί-Ιδ αντισωμάτων λειτουργεί προστατευτικά. Η προληπτική χορήγηση ενδοφλέβιας ανοσοσφαιρίνης (ΕΦΑΣ) σε αντί-Ro/La+ εγκύους βρέθηκε ότι αλλάζει σημαντικά το δίκτυο των Ιδ/αντί-Ιδ αντί-La/SSB αυτοαντισωμάτων. Επίσης, η αναλογία των Ιδ:αντί-Ιδ αντισωμάτων ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη σε μητέρες που γέννησαν υγιές παιδί σε σχέση με την αντίστοιχη αναλογία των μητέρων που γέννησαν παιδί με νεογνικό λύκο.Τέλος, μελετήθηκε ο ρόλος της ενεργοποίησης του υποδοχέα TLR3 στη ρύθμιση της παραγωγής των ενδοκυττάριων αυτοαντιγόνων Ro52/TRIM21, Ro60/TROVE2 και La/SSB σε επιθηλιακά κύτταρα των σιελογόνων αδένων (ΕΚΣΑ) ασθενών με σύνδρομο Sjögren. Επίδραση με το ανάλογο του συνδέτη του TLR3, polyI:C, αλλά όχι με το συνδέτη του TLR4, LPS, επήγαγε την έκφραση του Ro52/TRIM21-mRNA από τα ΕΚΣΑ σε δύο βήματα, στις 6-ώρες (12-πλάσια αύξηση) και στις 24-48-ώρες (2.5-φορές επιπλέον). Επιπρόσθετα, στις 48-ώρες αύξανε την έκφραση των Ro60/TROVE2 και La/SSB mRNAs (2.5-φορές). Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών Ro52/TRIM21, Ro60/TROVE2 και La/SSB δεν επηρεάστηκαν σημαντικά. Ωστόσο, η επίδραση με polyI:C (48-72-ώρες), αλλά όχι LPS, οδήγησε στην ανακατανομή της πρωτεΐνης Ro52/TRIM21 στον πυρήνα των ΕΚΣΑ, από πυρηνισκική σε πολλαπλές αδρές κουκίδες που εκτείνονται σε όλο τον πυρήνα. Η έκφραση των αυτοαντιγόνων στα HeLa (νεοπλασματική επιθηλιακή σειρά-μάρτυρας) δεν επηρεαζόταν. Η μέτρηση των εκκρινόμενων ιντερφερονών και πειράματα αναστολής έδειξαν ότι η δεύτερη αύξηση του Ro52/TRIM21-mRNA και η ανακατανομή της πρωτεΐνης στα ΕΚΣΑ μεσολαβούνται από την παραγωγή IFNβ, και όχι IFNα ή IFNγ. Έτσι, υποδηλώνεται ότι τα μονοπάτια της φυσικής ανοσίας μπορεί να εμπλέκονται στην επαγωγή της παραγωγής και την παρουσίαση των αυτοαντιγόνων στο ανοσοποιητικό σύστημα. Τα καινοτόμα ευρήματα της διατριβής αυτής είναι:1.Η εξήγηση της διασωματιακής επέκτασης επιτόπων2.Η ρυθμιστική δράση της ΕΦΑΣ στο ιδιοτυπικό/αντί-ιδιοτυπικό δίκτυο παθογενετικών αντισωμάτων3.Η μεσολάβηση του TLR3 στη ρύθμιση της έκφρασης ενδοκυττάριων αυτοαντιγόνων.