Πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τα επίπεδα και τις λειτουργίες της HDL: νέες προοπικές για τη θεραπεία της καρδιαγγειακής νόσου

Abstract

Many studies have shown that HDL has a plethora of functions that may contribute to theprotection from cardiovascular disease. The pathway of the biogenesis and catabolism of HDL isa complex process and involves several membrane bound and plasma proteins. Usingadenoviruses mediated gene transfer in various mouse models, the studies described in thisthesis explore the pathway of the biogenesis of HDL and more specifically the following:1. The importance of the hydrophobic residues in the 218-230 region of apoA-I in thebiogenesis of HDL.2. The effects of LCAT mutations on the biogenesis of HDL.3. The effects of CTα on the biogenesis of HDL.4. The contribution of dominant mutations in apoE to lipid homeostasis and the biogenesisof HDL.5. The synergy of apoA-IV and LCAT on the biogenesis of apoA-IV containing HDL.6. The effect of reconsituted HDL containing apoE and apoA-I on endothelial geneexpression.The importance of the hydrophobic residues in the 218-230 region of apoA-I in the biogenesisof HDLWe have investigated the significance of hydrophobic residues 218-230 on the structureand functions of apoA-I and their contribution to the biogenesis of HDL. We introduced threesets of point mutations in the 218-230 region of apoA-I substituting hydrophobic residues with Alanies. Adenovirus-mediated gene transfer of apoA-I[L218A/L219A/V221A/L222A] in apoA-I-/-mice decreased plasma cholesterol and apoA-I levels to 15% of WT control, and generatedpreβ and α4 HDL particles. In apoA-I-/- x apoE-/- mice the same mutant formed few discoidaland preβ HDL particles that could not be converted to mature α-HDL particles by excessLecithin cholesterol acyltransferase (LCAT). Adenovirus-mediated gene transfer of the apoAI[F225A/V227A/F229A/L230A] mutant in apoA-I-/- mice decreased plasma cholesterol, HDLcholesterol and apoA-I levels. When expressed in apoA-I-/- x apoE-/- mice, approximately 40% ofthe mutant apoA-I as well as mouse apoA-IV and apoB-48 appear in the VLDL/IDL/LDL. In bothmouse models the apoA-I mutant generated small spherical particles of preβ and α4 HDLmobility. Co-expression of the apoA-I mutant and human LCAT increased and shifted the HDLcholesterol peak towards lower densities, created normal α-HDL subpopulations and generatedspherical HDL particles. The apoA-I[218-222] and apoA-I[225-230] mutants had 20% and 31% respectively to promote ABCA1-mediated cholesterol efflux as compared to WT apoA-I. Bothmutants had ~65% of normal capacity to activate LCAT in vitro. Biophysical analyses suggestedthat both mutants affected the structural integrity and plasticity of apoA-I that is necessary fornormal functions. Adenovirus mediated gene transfer of apoAI[L218A/L219A/V221A/L222A/F225A/V227A/F229A/L230A] in apoA-I-/- had a similar phenotypeto apoA-I[L218A/L219A/V221A/L222A] that could not be corrected by excess LCAT. Weconclude that the alteration of the hydrophobic 218-222 residues of apoA-I disrupts apoAI/ABCA1 interactions and promotes the generation of defective preβ particles that fail tomature into α-HDL subpopulations, thus resulting in low plasma apoA-I and HDL. Alterations ofthe hydrophobic residues 225-230 also inhibited the biogenesis of HDL and led to the accumulation of immature preβ and α4 HDL particles, a phenotype that could be corrected byadministration of LCAT.The effects of LCAT mutations and CTα on the biogenesis of HDLWe have investigated the effect of overexpression of CTP:phosphocholinecytidylyltransferase (CTα) as well as LCAT mutants on the biogenesis of HDL in different mousemodels. Adenovirus-mediated gene transfer of human apoA-I along with CTα in apoA-I-/- miceincreased plasma cholesterol and phospholipid levels, mainly due to an increase in the HDLfraction, increased the large size HDL subpopulations and formed spherical HDL particles. Genetransfer of WT LCAT in LCAT-/- mice greatly increased total plasma cholesterol levels mainly dueto increase in HDL cholesterol. In contrast gene transfer of human LCAT carrying the naturalmutations LCAT[T123I] and LCAT[P250S] affected moderately plasma cholesterol levels.Fractionation of plasma by density gradient ultracentrifugation showed that WT LCAT increasedthe plasma apoE and apoA-IV levels and shifted the distribution of apoA-I to lower densities.The LCAT[T123I] and LCAT[P250S] mutants restored partially the presence of apoA-I in theHDL2/HDL3 fraction and in the case of the LCAT[T123I] mutant increased apoE in theVLD/IDL/LDL fractions. The LCAT[T123I] caused a biphasic and LCAT[P250S] a monophasicdistribution of the HDL cholesterol. Deficiency in LCAT is associated with formation of two preβHDL subpopulations and small size α-HDL particles. Gene transfer of the LCAT[T123I] andLCAT[P250S] mutants in LCAT-/- mice generated preβ and α-HDL subpopulations with similarsize whereas treatment with WT LCAT generated α-HDL subpopulations. Co-expression of thethe apoA-I[L159R]Fin or the apoA-I[225-230] with LCAT restored the defective HDL phenotype casued by the mutant apoA-I forms. In contrast, co-expression of LCAT[T123I] and LCAT[P250S]with either of the apoA-I[L159R]Fin or the apoA-I[225-230] only moderately restored the HDLphenotype. We conclude that overexpression of CTα and LCAT promotes the biogenesis of HDLand the mutations in LCAT affect differently the biogenesis of HDL.The contribution of dominant mutations in apoE to lipid homeostasis and the biogenesis ofHDLThe K146N/R147W substitutions in human apoE3 were first described in patients with adominant form of type III hyperlipoproteinemia. The effects of these mutations on the in vivofunctions of apoE were studied by adenovirus mediated gene transfer of the full length and atruncated apoE3[K146N/R147W]-202 mutant using different mouse models. A low dose of adenovirus expressing the apoE3[K146N/R147W] mutant in apoE-/- or apoA-I-/- x apoE-/- miceexacerbated the hypercholesterolemia and increased greatly plasma apoE and triglycerideslevels. In apoE-/- mice the apoE3[K146N/R147W] mutant displaced apoA-I from the VLDL/LDL/HDL region and resulted in the accumulation of discoidal apoE containing HDL particles inplasma. Similar doses of WT apoE3 cleared the cholesterol of apoE-/- mice without induction ofhypertriglyceridemia and promoted formation of spherical HDL particles. A unique feature ofthe truncated apoE3[K146N/R147W]-202 mutant is that it prevented the induction ofhypertriglyceridemia but did not correct the hypercholesterolemia. Other apoE-202 truncatedmutants tested previously did not induce hypertriglyceridemia but correctedhypercholesterolemia. Treatment of apoE-/- mice with apoE3[K146N/R147W] and lipoproteinlipase corrected the hypertriglyceridemia but did not prevent the formation of discoidal HDL.Treatment with LCAT also corrected hypertriglyceridemia normalized the CE/TC ratio of plasmaand generated spherical HDL. The combined data indicate that the K146N/R147W substitutionsin the full length and the truncated apoE3[K146N/R147W] mutant prevent receptor-mediatedremnant clearance. The accumulation in plasma of lipoprotein remnants that contain the fulllength apoE3[K146N/R147W] mutant suggests that this mutant acts as a dominant negativeligand that exacerbates the dyslipidemia and also affects the activity of LCAT thus inhibiting thebiogenesis of HDL.The synergy of apoA-IV and LCAT on the biogenesis of apoA-IV containing HDLWe studied the contribution of LCAT on the biogenesis of apoA-IV containing HDL.Adenovirus-mediated gene transfer of apoA-IV in LCAT-/- failed to show the formation ofspherical and α-migrating HDL particles. Adenovirus-mediated gene transfer of apoA-IV inapoA-I-/- mice did not change plasma lipid levels. ApoA-IV floated predominantly in the HDL3region. Co-expression of apoA-IV and LCAT in apoA-I-/- mice restored the formation of HDL-A-IV.The findings are consistent with a novel function of apoA-IV in the biogenesis of discrete HDL-AIVparticles with the participation of LCAT, and may explain previously reported antiinflammatoryand atheroprotective properties of apoA-IV.The effect of reconsituted HDL containing apoE and apoA-I on endothelial gene expressionWe performed reliminary microarray experimetns in human aortic endothelial cells(HAECs) following treatment of reconstituted HDL containing apoA-I (using phospholipids and cholesterol, designated as rHDLAI+, or phospholipids alone, designated as rHDLAI-) or apoE(rHDLE+ and rHDL-). The bioinformatics analyses showed that the rHDLAI- and rHDLAI+treatments caused the differential expression (over 2-fold change and ≤ 0.05 FDR) in 137 and190 genes respectively. The differentially expressed genes in response to rHDLE3- and rHDLE3+were 198 and 272 respectively. The microarrays data were validated with high throughput qRTPCRbased screening using the dynamic array chips. Pathways of highly interconnected geneswere tentatively identified based the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) program and pubmedliterature searches.

Πολυάριθμες επιδημιολογικές και γενετικές μελέτες καθώς και μελέτες σε μοντέλα ζώωνέχουν δείξει ότι HDL έχει έναν μεγάλο αριθμό λειτουργιών που μπορεί να συμβάλουν στηνπροστασία από την καρδιαγγειακή νόσο. Ο μεταβολισμός της HDL είναι μια σύνθετηδιαδικασία και περιλαμβάνει τη δράση πρωτεϊνών της κυτταρική μεμβράνης καθώς καιπρωτεϊνών του πλάσματος. Στη διατριβή αυτή περιγράφονται πειράματα που διερευνούν τομονοπάτι του σχηματισμού της HDL χρησιμοποιώντας γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών σεδιάφορα ζωικά μοντέλα ποντικο. Πιό συγκεκριμένα μελετήσαμε τα εξής:1. Τη σημασία των υδρόφοβων αμινοξέων στην περιοχή 218-230 της apoA-I στοσχηματισμό της HDL.2. Την επίδραση μεταλλάξεων στην LCAT στο σχηματισμό της HDL.3. Την επίδραση του ενζύμου CTα στο σχηματισμό της HDL.4. Η συμβολή των επικρατουσών μεταλλάξεων της apoE στην ομοιόσταση των λιπιδίων και στο σχηματισμό της HDL.5. Η σύμπραξη της apoA-IV και της LCAT στο σχηματισμό της HDL που περιέχει apoA-IV.6. Η επίδραση της HDL που περιέχει apoE ή apoA-I στην έκφραση γονιδίων τωνενδοθηλιακών κυττάρων. Η σημασία των υδρόφοβων αμινοξέων στην περιοχή 218-230 της apoA-I στο σχηματισμότης HDLΜελετήσαμε τη σημασία των υδρόφοβων αμινοξέων στο καρβοξυτελικό άκρο τηςapoA-I στη δομή και τις λειτουργίες της καθώς και τη συμβολή τους στο σχηματισμό της HDL.Συγκεκριμένα, εισαγάγαμε τρία σετ σημειακών μεταλλάξεων στην περιοχή 218-230 της apoA-I,αντικαθιστώντας τα υδρόφοβα αμινοξέα με Αλανίνες. Γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊώντης μεταλλαγμένης μορφής apoA-I[L218A/L219A/V221A/L222A] σε apoA-I-/- ποντίκια μείωσετη χοληστερόλη του πλάσματος και τα επίπεδα της apoA-I στο 15% σε σ χέση μ ε τ ην α γρίουτύπου apoA-I και οδήγησε στι σχηματισμό preβ και α4 HDL. Στα apoA-I-/- x apoE-/- ποντίκια ηίδια μετάλλαξη οδήγησε στο σχηματισμό δισκοειδών σωματιδίων HDL και preβ HDL που δενμπορούν να μετατραπούν σε ώριμους α-HDL υποπληθυσμούς με υπερέκφραση της LCAT. Γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών της μεταλλαγμένης μορφής apoAI[F225Α/V227A/F229A/L230A] σε apoA-I-/- ποντίκια μείωσε τη χοληστερόλη του πλάσματος, τηχοληστερόλη της HDL και τα επίπεδα της apoA-I. Όταν αυτη η μεταλλαγμένη μορφής της apoAIεκφράστηκε σε apoA-I-/- x apoE-/- ποντίκια, περίπου το 40% της μεταλλαγμένης apoA-I καθώςεπίσης η ποντικίσια apoΑ-IV και apoB-48 εντοπίστηκε στα κλάσματα των VLDL/IDL/LDL. Και σταδύο μοντέλα ποντικιών, η apoA-I[F225Α/V227A/F229A/L230A] οδήγησε στο σχηματισμόμικρών σφαιρικών preβ κ αι α 4-HDL σωματιδίων. Συνέκφραση της apoAI[F225Α/V227A/F229A/L230A] και της LCAT αύξησε και μετατόπισε την καμπύλη τηςχοληστερόλη της HDL προς τα κλάσματα χαμηλότερης πυκνότητας, και οδήγησε στοσχηματισμό των φυσιολογικών υποπληθυσμών της HDL. Οι μεταλλάξεις apoA-I[218-222] καιapoA-I[225-230] είχαν το 20% και 31% αντίστοιχα της ικανότητας της αγρίου τύπου apoA-I να προάγουν την εκροή χοληστερόλη μέσω της ABCA1. Επίσης και οι δύο μεταλλάξεις είχαν το~65% της ικανότητας της αγρίου τύπου apoA-I να ενεργοποιήσουν την LCAT in vitro. Οιβιοφυσικές αναλύσεις έδειξαν ότι και οι δύο μεταλλάξεις είχαν επιπτώσεις στη δομή και τηνπλαστικότητα της apoA-I που είναι απαραίτητη για τις κανονικές της λειτουργίες. Γονιδιακήμεταφορά μέσω αδενοϊών της μεταλλαγμένης μορφής apoAI[L218A/L219A/V221A/L222A/F225Α/V227A/F229A/L230A] σε apoA-I-/- ποντίκια δημιούργησεπαρόμοιο φαινότυπο με την apoA-I[L218A/L219A/V221A/L222A] ο οποίος δεν μπορούσε ναδιορθωθεί με την υπερέκφραση της LCAT. Συμπερασματικά, η αλλαγή των υδρόφοβωναμινοξέων στη περιοχή 218-222 της apoA-I διαταράσσει την αλληλεπίδραση μεταξύ της apoΑ-Iκαι της ABCA1 και οδηγεί στο σχηματισμό ελαττωματικών preβ υποπληθυσμών πουαποτυγχάνουν να ωριμάσουν σε ώριμη α-HDL με αποτέλεσμα τα χαμηλά επίπεδα της apoA-Iκαι της HDL στο πλάσμα. Οι μεταλλάξεις των υδρόφοβων αμινοξέων στην περιοχή 225-230 της apoΑ-I επίσης εμπόδισαν τη βιογένεση της HDL και οδήγησαν στη συσσώρευση ανώριμωνpreβ κ αι α 4-HDL υποπληθυσμών μόρια, ένας φαινότυπος που μπορεί ν α δ ιορθωθεί μ ε τ ηνυπερέκφραση της LCAT.Η επίδραση των μεταλλαγών της LCAT και της υπερέκφρασης της CTα στη βιογένση της HDLΜελετήσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης του ενζύμου cytidylyltransferaseCTP:phosphocholine (CTα) καθώς επίσης και μεταλλάξεων της LCAT στη βιογένεση της HDL σεδιάφορα μοντέλα ποντικών. Γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών της apoA-I μαζί με την CΤασε apoA-I-/- ποντίκια αύξησε τη χοληστερόλη του πλάσματος, τα επίπεδα των φωσφολιπιδίων,τους μεγάλου μεγέθους α1-HDL υποπληθυσμούς και οδήγησε στη διαμόρφωση σφαιρικώνσωματιδίων HDL. Γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών της αγρίου τύπου LCAT σε LCAT-/- ποντίκια αύξησε πολύ τα συνολικά επίπεδα χοληστερόλης πλάσματος που οφείλονται κυρίωςστην αύξηση στη χοληστερόλη της HDL. Αντίθετα η γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών τηςLCAT που φέρει τις φυσικές μεταλλαξεις LCAT[T123Ι] και LCAT[P250S] επηρέασε σε μικρότεροβαθμό τα επίπεδα της χοληστερόλης του πλάσματος. Κλασμάτωση του πλάσματος μευπερφυγοκέντριση σε διαβάθμιση KBr έδειξε ότι η αγρίου τύπου LCAT αύξησε τα επίπεδα τηςapoE και apoA-IV του πλάσματος και μετατόπισε την apoA-I στα κλάσματα χαμηλότερηςπυκνότητας. Οι μεταλλάξεις LCAT[T123Ι] και LCAT[P250S] αποκατέστησαν μερικώς τηνπαρουσία της apoA-I στα κλάσματα της HDL2/HDL3 και στην περίπτωση της μετάλλαξηςLCAT[T123Ι] αύξησε την apoE στα κλασματα της VLD/IDL/LDL. Τα LCAT-/- ποντίκια σχγματίζουνδύο υποπληθυσμούς preβ HDL και έναν α4-HDL. Οι μεταλλάξεις LCAT[T123Ι] και LCAT[P250S]παρήγαγαν preβ και α4,α3,α2-HDL υποπληθυσμούς ενώ η αγρίου τύπου LCAT παρήγαγε μόνοα-HDL μεγάλου μεγέθους. Συνέκφραση της apoA-I[L159R]Fin ή της apoA-I[225-230] με την LCAT αποκατέστησε τον ελαττωματικό φαινότυπο της HDL που δημιουργούν οι μεταλλάξειςapoA-I[L159R]Fin και apoA-I[225-230]. Αντίθετα, η συνέκφραση οποιασδήποτε από τιςμεταλλάξεις LCAT[T123Ι] και LCAT[P250S] είτε με την apoA-I[L159R]Fin ή την apoA-I[225-230]δεν αποκατήστησε πλήρως το φαινότυπο της HDL. Συμπέρασματικά η υπερέκφραση της CΤακαι της LCAT προάγει τη βιογένεση της HDL ενώ οι μεταλλάξεις στην LCAT επιδρούν αρνητικάστην βιογένεση της HDL. Η συμβολή επικρατουσών μεταλλάξεων της apoE στην ομοιόσταση των λιπιδίων και στηνβιογένεση της HDLΟι σημειακές μεταλλάξεις K146N/R147W στην ανθρώπινη apoΕ3 περιγράφηκαν για πρώτηφορά σε ασθενείς με μια κυρίαρχη μορφή της υπερλιποπρωτεϊναιμίας τύπου III. Οι επιδράσειςτων μεταλλάξεων αυτών στις in νίνο λειτουργίες της apoE μελετήθηκαν με γονιδιακήμεταφορά μέσω αδενοϊών των apoE3[K146N/R147W] και apoE3[K146N/R147W]-202 σεδιάφορα μοντέλα ποντικών. Η έκφραση της apoE3[K146N/R147W] σε χαμηλά επίπεδα σεapoE-/- ή apoA-I-/- x apoE-/- ποντίκια επιδείνωσε την υπερχοληστερολαιμία και αύξησεσημαντικά την συγκέντρωση της apoE και των τριγλυκεριδίων. Στα apoE-/- ποντίκια ημετταλεγμένη μορφή apoE3[K146N/R147W] εκτόπισε την aροΑ-Ι από όλα τα κλάσματα τωνVLDL/LDL/HDL και οδήγησε στη συσσώρευση στο πλάσμα δισκοειδών σωματιδίων HDL που περιέχουν apoE. Παρόμοιες δόσεις αγρίου τύπου apoE3 σε apoE-/- ποντίκια οδήγησαν στοκαθαρισμό της χοληστερόλης από το πλάσμα, χωρίς την επαγωγή υπερτριγλυκεριδαιμίας, καιστον σχηματισμό σφαιρικών σωματιδίων HDL. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό τηςμεταλλαγμένης μορφής apoE3[K146N/R147W]-202 είναι ότι εμπόδισε την επαγωγήυπερτριγλυκεριδαιμίας, αλλά δεν διόρθωσε την υπερχοληστερολαιμία. Συνέκφραση τηςapoE3[K146N/R147W] και της LPL σε apoE-/- ποντίκια διόρθωσε την υπερτριγλυκεριδαιμία, αλλάδεν εμπόδισε τον σχηματισμό της δισκοειδούς HDL. Συνέκφραση της apoE3[K146N/R147W]και της LCAT επίσης διόρθωσε την υπερτριγλυκεριδαιμία, τα επίπεδα των εστέρων τηςχοληστερόλης του πλάσματος και οδήγησε στη παραγωγή σφαιρικής HDL. Συμπερασματικά, οιαντικαταστάσεις K146N/R147W αποτρέπουν τον καθαρισμό της χοληστερόλης, επιδεινώνουν την δυσλιπιδαιμία και επηρεάζουν την λειτουργία της LCΑT αναστέλλοντας έτσι την βιογένεσητης HDL .Η σύμπραξη της apoΑ-IV και της LCAT στη βιογένεση της HDL που περιέχει apoΑ-IVΜελετήσαμε τη συμβολή LCAT στη βιογένεση της HDL που περιέχει apoΑ-IV. Γονιδιακήμεταφορά μέσω αδενοϊών της apoΑ-IV σε LCAT-/- ποντίκια απέτυχε να σχηματίσει HDL.Μεταφορά της apoΑ-IV σε apoA-I-/- ποντίκια δεν επηρέασε τα επίπεδα των λιπιδίων τουπλάσματος ενώ η apoΑ-IV εντοπιστηκε στα κλάσματα της HDL3. Συνέκφραση της apoΑ-IV καιτης LCAT σε apoA-I-/- ποντίκια αποκατέστησε το σχηματισμό της HDL που περιέχει apoΑ-IV. Τααποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η apoΑ-IV μπορεί να σχηματίσει μοναδικους πληθυσμούςHDL που περιέχουν apoA-IV με τη συμμετοχή της LCAT, και δίνουν μια πιθανή εξηγήση για τιςαντιφλεγμονώδεις και αθηρωπροστατευτικές ιδιότητες της apoΑ-IV. Η επίδραση της τεχνητής HDL που περιέχει apoE και apoA-I στην γονιδιακή έκφραση τωνενδοθηλιακών κυττάρωνΠροκαταρτικά πειράματα μικροσυστοιχιών RNA από ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα τηςαορτής μετά από την έκθεσή τους σε τεχνητή HDL που περιέχει apoA-I [χρησιμοποιώνταςφωσφολιπίδια και χοληστερόλη (rHDLAI+) ή μόνο φωσφολιπίδια (rHDLAI-)] ή apoE (rHDLE+ καιrHDL-). Οι αναλύσεις βιοπληροφορικής έδειξαν ότι η rHDLAI– και η rHDLAI+ προκάλεσαν τηδιαφορική έκφραση σε 137 και 190 γονίδια αντίστοιχα. Ομοίως στην περίπτωση των rHDLE3-και rHDLE3+ παρατηρήθηκαν διαφορές σε 198 και 272 γονίδια αντίστοιχα. Οι μικροσυστοιχίεςRNA επιβεβαιώθηκαν με qΡRT-PCR. Χρησιμοποιώντας το λογισμικό IPA analysis καθώς και εκτεταμένη έρευνα στη βιβλιογραφία σχηματίσαμε προτακαρτικά σηματοδοτικά μονοπάτιαστα οποία συμμετέχουν τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που εντοπίστηκαν.