Μελέτη των γονιδίων των αγγειοποιητινών GA733-1/-2 και CEA σε ασθενείς με καρκίνο παχέος εντέρου

Abstract

The colo-rectal cancer is the fourth most common type of cancer in both the male and the female population and the second cause of death from cancer in the US. In recent years, however, there is a significant reduction of disease effect. This reduction in disease mortality is a result of progress in the prevention and early detection of cancer through preventive tests and improved therapeutic agents available to physicians. Colorectal cancer is a heterogeneous disease with a different therapeutic strategy for each patient. This strategy is determined by the stage of the disease and the biology of the tumor. The evolution of the molecular study of the carcinogenesis has greatly helped in understanding the genetic nature of colorectal cancer, although there are still many to be done. This study is focused on the genetic basis of colorectal cancer by analyzing 40 patients with colorectal cancer. DNA was isolated from the peripheral blood of these patients as well as RNA from tumor cells and from cells of non-diseased intestinal mucosa from adjacent positions in order to clarify the expression of the genes in normal and in pathological tissue of the intestinal mucosa. This was followed by quantitative reaction of the Polymerase chain reaction-reverse transcription (q-RT-PCR) to determine the expression of the GA733-1, GA733-2, CEACAM5, Ang-1 and Ang-2 genes. These results were then correlated with clinicopathological features of the patients. The expression of the GA733-1gene was almost undetectable in both noncancerous mucosal tissue and cancerous tissue, while the expression of the GA733-2 gene was detectable in all samples. The mean value of GA733-2/h-PBGD mRNA was 273.31 (65.24-1,486.41) and 115.64 (11.58-1-189.14) in noncancerous and cancerous tissue, respectively (p=0.0000195). Significant correlations were found between the GA733-2 gene expression and the stage N of the disease (p=0,0343) as well as with the presence or absence of lymph node infiltration (p=0,008668). The expression of the CEACAM5 gene was detected in all samples with mean value CEACAM5/h-PBGD mRNA: 326,36 (11,97-3.3562,61) and 317,60 (3,37 to 8.896,42) in the non-cancerous and cancerous tissue. A significant correlation was detected between the expression of CEACAM5 gene and the degree of tumor cell differentiation (p=0.0465). The levels of carcino embryonic antigen in human serum were assessed in more than 50% of the samples. The mean value of CEA levels in peripheral serum was 6,5715 (0,86-24,95), while a correlation of CEACAM5 gene and their levels in the peripheral blood was not detected in cancerous cells. Finally, Ang-1 and Ang-2 genes are expressed in all analyzed samples. The mean value of Ang-1/h-PBGD mRNA was 3,6248 (0,0530-16,5433) and 0,9373 (0,0002-11,2039) in the non-cancerous and cancerous tissue, respectively. Concerning the expression of Ang-2, the mean value of Ang-2/h-PBGD gene was 0,7492 (0,0012-5,3992) in noncancerous tissue and 1,4122 (0,0020-0,9665) in cancerous tissue. Significant correlations were observed between the expression of Ang-1 gene and the T stage of the tumor (p=0.04536) as well as Ang-2 gene expression and the tumor cell differentiation grade (p=0.0049). Moreover, the expression level of Ang-1/Ang-2 genes was correlated with the T phase of the tumor (p=0.0364) and the presence of lymph node (N) according to the TNM staging system (p=0.0363).In conclusion, the extremely low levels of the GA733-1 gene detected in our samples was in accordance with the knowledge for the expression of this gene only in colorectal cancer with liver metastasis; the levels of GA733-2 mRNA transcripts were significantly correlated with the N stage of disease as well as with the presence or absence of lymph node infiltration. The increased expression of CEACAM5 gene might be related to the tumor cell differentiation grade, while it was not detected any correlation between the expression of CEACAM5 in cancer cells and its level in peripheral blood. Concerning the expression of Ang-1 and Ang-2 genes, it is evident that as the T phase of the tumor is increased the expression of Ang-1 is reduced, while the low levels of Ang-2 gene were observed in low-grade tumor cells differentiation. Finally, the diversification of the expression of the two angiopoietins in the tumor tissue was correlated with the T stage of the tumor as well as with the presence of lymph node metastasis (N). These results suggest that a better understanding of colorectal cancer biology will significantly contribute to a more rational and effective treatment of the disease.

Ο κολο-ορθικός καρκίνος αποτελεί τον τέταρτο πιο συχνό τύπο καρκίνου τόσο στον αντρικό όσο και στο γυναικείο πληθυσμό και τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ. Τα τελευταία χρόνια όμως παρατηρείται σημαντική μείωση της επίπτωσης της νόσου. Η μείωση αυτή της θνητότητας της νόσου είναι απόρροια της προόδου στην πρόληψη και στην έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου μέσω των προληπτικών ελέγχων, της καλύτερης διάγνωσης και της βελτίωσης των θεραπευτικών μέσων που διατίθενται. Ο κολο-ορθικός καρκίνος είναι μία ετερογενής νόσος με διαφορετική θεραπευτική στρατηγική για τον κάθε ασθενή που καθορίζεται από το στάδιο της νόσου και τη βιολογία του όγκου. Η εξέλιξη της μελέτης της μοριακής βάσης της καρκινογένεσης έχει βοηθήσει σημαντικά την κατανόηση της γενετικής φύσης του κολο-ορθικού καρκίνου, αν και υπάρχουν ακόμα πολλά προς διερεύνηση.Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάστηκε στη μελέτη της γενετικής βάσης του κολο-ορθικού καρκίνου μελετώντας 40 ασθενείς με κολο-ορθικό καρκίνο, από τους οποίους απομονώθηκε γενετικό υλικό τόσο από τα καρκινικά κύτταρα του όγκου όσο και από κύτταρα του μη νοσούντος εντερικού βλεννογόνου από παρακείμενες θέσεις προκειμένου να παρατηρήσουμε την έκφραση γονιδίων στο φυσιολογικό και παθολογικό ιστό του εντερικού βλεννογόνου. Στη συνέχεια ακολούθησε ποσοτική αντίδραση αλυσιδωτής αντίδρασης Πολυμεράσης-αντίστροφης μεταγραφής (q-RT-PCR) για τον προσδιορισμό της ποσοτικής έκφρασης των γονιδίων GA733-1, GΑ733-2, CEACAM5, Ang-1 και Ang-2. Τα αποτελέσματα αυτά συσχετίστηκαν στη συνέχεια με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Η έκφραση του γονιδίου GA733-1 ήταν πολύ χαμηλή έως μη ανιχνεύσιμη τόσο στο μη καρκινικό βλεννογονικό ιστό όσο και στον καρκινικό. Η έκφραση του γονιδίου GA733-2 ήταν ανιχνεύσιμη σε όλα τα δείγματα και η μέση τιμή GA733-2/h-PBGD ήταν 273,31 (65.24-1,486.41) και 115,64 (11.58-1-189.14???) στο μη καρκινικό και καρκινικό ιστό, αντιστοίχως (p = 0.0000195). Στατιστικώς σημαντικές συσχετίσεις εντοπίστηκαν μεταξύ της έκφρασης του γονιδίου GA733-2 και το στάδιο Ν της νόσου (p = 0,0343) και με την παρουσία ή μη λεμφαδενικής διήθησης (p=0,008668). Η έκφραση του CEACAM5 γονιδίου στον ιστό ήταν ανιχνεύσιμη σε όλα τα δείγματα με μέση τιμή CEACAM5/h-PBGD mRNA: 326,36 (11,97-3.3562,61) στο μη καρκινικό ιστό, ενώ στον καρκινικό ιστό η μέση τιμή CEACAM5/h-PBGD mRNA ήταν 317,60 (3.37 έως 8896.42). Σημαντική συσχέτιση εντοπίστηκε μεταξύ της έκφρασης του CEACAM5 γονιδίου και του βαθμού διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων (p=0.0465). Τα επίπεδα του καρκινο-εμβρυϊκού αντιγόνου στον ανθρώπινο ορό αξιολογήθηκε σε περισσότερους από το 50% των δειγμάτων. Η μέση τιμή των επιπέδων του CEA στο περιφερικό ορό ήταν 6,5715 (0,86-24,95), ενώ δεν εντοπίστηκε κάποια συσχέτιση της έκφρασης του CEACAM5 στα καρκινικά κύτταρα και των επιπέδων τους στο περιφερικό αίμα. Τέλος, τα γονίδια Ang-1 και Ang-2 εκφράζονται σε όλα τα υπό μελέτη δείγματα. Η μέση τιμή έκφρασης Ang-1/h-PBGD ήταν 3,6248 (0,0530-16,5433) και 0,9373 (0,0002-11,2039) στο μη καρκινικό και καρκινικό ιστό, αντιστοίχως. Ως προς την έκφραση του γονιδίου Ang-2, η μέση τιμή Ang-2/h-PBGD ήταν 0,7492 (0,0012-5,3992) στο μη καρκινικό ιστό και 1,4122 (0,0020-10,9665) στον καρκινικό ιστό. Παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης του γονιδίου Ang-1 και του σταδίου Τ του όγκου (p=0.04536) καθώς και του γονιδίου Ang-2 και του βαθμού διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων (p=0.0049). Αναλύοντας τα αποτελέσματά μας προέκυψε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων Ang-1/Ang-2 και του σταδίου Τ του όγκου (p= 0.0364) καθώς και με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (Ν) σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης κατά ΤΝΜ (p= 0.0363).Συμπερασματικά, η έκφραση του γονιδίου GA733-1 συσχετίστηκε με την ανάπτυξη ηπατικών μεταστάσεων και του GA733-2 γονιδίου με το στάδιο Ν της νόσου. Η αυξημένη έκφραση του CEACAM5 γονιδίου πιθανόν να εμπλέκεται στο βαθμό διαφοροποίησης των καρκινικών κυττάρων, ενώ δεν εντοπίστηκε κάποια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του CEACAM5 στα καρκινικά κύτταρα και των επιπέδων του στο περιφερικό αίμα. Ως προς την έκφραση των γονιδίων Ang-1 και Ang-2 προέκυψε ότι όσο αυξάνεται το στάδιο Τ του όγκου τόσο μειώνεται η έκφραση της Ang-1, ενώ η μειωμένη έκφραση της Ang-2 παρατηρήθηκε στα χαμηλού βαθμού διαφοροποίησης καρκινικά κύτταρα. Τέλος, η διαφοροποίηση της έκφρασης των δύο αγγειοποιητινών στον καρκινικό ιστό συσχετίστηκε με το στάδιο Τ του όγκου (p= 0.0364) καθώς επίσης και με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (Ν). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η καλύτερη κατανόηση της βιολογίας του κολο-ορθικό καρκίνου θα συμβάλει σημαντικά στην ορθολογικότερη και αποτελεσματικότερη θεραπεία της ασθένειας.