Επιγενετικοί μηχανισμοί φυλετικής πλαστικότητας στον εγκέφαλο του zebrafish (Danio rerio)

Abstract

The subject of this thesis is to evaluate epigenetic mechanisms of sexual brain plasticity in the neurogenic model-organism zebrafish (Danio rerio). Specifically, the role of the hormone 17-beta estradiol (sexual plasticity) and social hierarchy (social plasticity) in the adult brain were studied. Also, the role of estradiol was investigated in brain circuits that control social behavior. The birth of new cells in the adult brain, is an important mechanism of plasticity and teleosts have stunning neurogenesis capacity across the anterior-posterior axis of the brain in discrete proliferation zones, throughout their life. The main objective of this thesis was to investigate the effect of E2 in the birth of new cells in the brain of Danio rerio. E2 was administered to adult zebrafish for 24 hours and 7 days and immunohistochemical localization quantified by stereology the newborn cells in 11 discrete brain proliferative zones. E2 significantly modified the proliferation rate with sex-dependent manner, depending on the brain area and the time of administration. Short time administration increased the proliferation whereas, after a long time administration a marked decrease of neurogenesis was observed in the cerebellum (Val, Vam, CCe) and preoptic area in both sexes, while the ventral hypothalamus and forebrain decrease was sex-dependent. The relationship between E2 and monoamines in zebrafish brain was studied by quantifiacation of the levels of noradrenaline, dopamine and serotonin by HPLC, and the distribution of α2A and β2 adrenergic receptors was studied by immunofluorescence. E2 altered dopamine and serotonin function in the brain of zebrafish, as well as the expression of α2A AR in forebrain and cerebellum, and β2 AR in the dorsal nucleus of the hypothalamus (Hd) females, showing the modulating action of estrogen in the structure and function of neural circuits.The study of the relationship between hierarchical social behavior and function of neural circuits that control it was also the aim of the thesis. The aggressive behavior to obtain dominance and dominance index were quantified by analyzing dominant behavioral parameters in pairs of fish from several days of filming. Quantitation of newborn cells showed decreased proliferation in the cerebellum, hypothalamus and dorsal telencephalon nuclei that are part of the limbic system, for the subordinate males. Furthermore, lower levels of α2A and β2 ARs were obtain for the dorsal forebrain of subordinate fish. The results from the present study show the impact of social hierarchical behavior in the adult brain proliferation and the function of the adrenergic system and suggest the existence of a Network of Social Behaviour (SBN) in teleosts, homologous to the mammalian, including the amygdala, hippocampus, preoptic region, the ventral hypothalamus and cerebellum.For a better understanding of sexual plasticity mechanisms in the brain, we investigated the relationship between the social hierarchy and epigenetic actions of estradiol, in the modification of circuits identified as contributing to the hierarchical behavior. After a 7day administration of E2 in pairs of male zebrafish with stable social structures the dominance index, the cell proliferation rate and distribution of α2A and β2 ARs were quantified. A statistically significant difference between dominance index of subjects who received E2 for 7 days and controls, and modification of cell proliferation in the impact areas of the hierarchical behavior in the forebrain and cerebellum of dominant and subordinate individuals was observed. Results from the present study demonstrate the existence of epigenetic mechanisms of plasticity in the brain of Danio rerio related to the function of adrenergic system and the proliferation of new cells. Estrogen and hierarchical social behavior appear to be important regulators of neuronal circuits of the fish brain, affecting remarkably neurogenesis and the function of neurotransmitter circuits.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η κατανόηση φύλο-εξαρτώμενων επιγενετικών μηχανισμών πλαστικότητας του εγκεφάλου με βάση το νευρογενετικό μοντέλο-οργανισμό zebrafish (Danio rerio). Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν, ο ρόλος της ορμόνης 17-β οιστραδιόλης (φυλετική πλαστικότητα) και της κοινωνικής ιεραρχίας (κοινωνική πλαστικότητα) στον ενήλικο εγκέφαλο. Επίσης, διερευνήθηκε ο ρόλος της οιστραδιόλης στα εγκεφαλικά κυκλώματα που ελέγχουν την κοινωνική συμπεριφορά.Η γέννηση νέων κυττάρων στον ενήλικο εγκέφαλο, αποτελεί κύριο μηχανισμό πλαστικότητας και οι τελεόστεοι ιχθύες παρουσιάζουν εκπληκτική ικανότητα νευρογένεσης σε ολόκληρο τον προσθιο-οπίσθιο άξονα του εγκεφάλου τους, σε διακριτές ζώνες πολλαπλασιασμού, καθόλη τη διάρκεια της ζωής τους. Η διερεύνηση της επίδρασης της Ε2 στη ρύθμιση της γέννησης νέων κυττάρων στον εγκέφαλο του Danio rerio αποτέλεσε κύριο στόχο της παρούσας διατριβής. Χορηγήθηκε Ε2 σε ενήλικα zebrafish για 24 ώρες και 7 μέρες και με ανοσοϊστοχημικό εντοπισμό χαρτογραφήθηκαν ποσοτικά με στερεολογία τα νεογεννηθέντα κύτταρα σε 11 διακριτές εγκεφαλικές ζώνες πολλαπλασιασμού. Η Ε2 τροποποίησε σημαντικά το ρυθμό πολλαπλασιασμού με φυλο-εξαρτώμενο τρόπο, ανάλογα με την υπό μελέτη περιοχή και το χρόνο χορήγησης. Βραχεία χορήγηση προκάλεσε αύξηση του πολλαπλασιασμού ενώ αντίθετα, μετά από μακρά χορήγηση παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη μείωση νευρογένεσης στην παρεγκεφαλίδα (Val, Vam, CCe) και στην προοπτική περιοχή και στα δύο φύλα, ενώ στον κοιλιακό υποθάλαμο, και τον τελεγκέφαλο η μείωση ήταν φυλοεξαρτώμενη. Επίσης, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της Ε2 με τις μονοαμίνες στο zebrafish με ποσοτικό προσδιορισμό επιπέδων της νοραδρεναλίνης, ντοπαμίνης και σεροτονίνης με HPLC, ενώ μελετήθηκε και η κατανομή των α2Α και β2 αδρενεργικών υποδοχέων με ανοσοφθορισμό. Η Ε2 τροποποίησε τη λειτουργία της ντοπαμίνης και σεροτονίνης στον εγκέφαλο του zebrafish, καθώς και της έκφρασης των α2Α ΑΥ στον τελεγκέφαλο και την παρεγκεφαλίδα, και των β2 ΑΥ στον ραχιαίο πυρήνα του υποθαλάμου (Hd) των θηλυκών, καταδεικνύοντας την τροποποιητική δράση των οιστρογόνων στη δομή και τη λειτουργία των νευρωνικών κυκλωμάτων.Η μελέτη της σχέσης μεταξύ εκδήλωσης της κοινωνικής ιεραρχικής συμπεριφοράς και λειτουργίας των νευρικών κυκλωμάτων που την ελέγχουν αποτέλεσε επίσης στόχο της διατριβής. Η επιθετική συμπεριφορά για την απόκτηση κυριαρχίας και ο δείκτης κυριαρχίας ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση παραμέτρων κυριαρχικής συμπεριφοράς σε δυάδες ιχθύων από πολυήμερη βιντεοσκόπηση. Η ποσοτικοποίηση των νεογεννηθέντων κυττάρων έδειξε μείωση του πολλαπλασιασμού στην παρεγκεφαλίδα, στον υποθάλαμο και στους πυρήνες του ραχιαίου τελεγκεφάλου που ανήκουν στο μεταιχμιακό σύστημα, στα υποτελή αρσενικά άτομα. Επίσης, προσδιορίστηκαν χαμηλότερα επίπεδα α2Α ΑΥ στον ραχιαίο τελεγκέφαλο των υποτελών ιχθύων ενώ αντίστοιχη μείωση παρουσίασαν τα επίπεδα των β2 ΑΥ στον ραχιαίο τελεγκέφαλο και στον υποθάλαμο. Τα αποτελέσματα από την παρούσα διατριβή παρουσιάζουν την επίδραση της κοινωνικής ιεραρχικής συμπεριφοράς στη γέννηση νέων κυττάρων και τη λειτουργία του αδρενεργικού συστήματος και προτείνουν την ύπαρξη ενός Δικτύου Εγκεφαλικού Ελέγχου της Κοινωνικής Συμπεριφοράς (SBN) αντίστοιχο των θηλαστικών που περιλαμβάνει την αμυγδαλή, τον ιππόκαμπο, την προοπτική περιοχή, τον κοιλιακό υποθάλαμο και την παρεγκεφαλίδα.Για την πληρέστερη κατανόηση των μηχανισμών φυλετικής πλαστικότητας στον εγκέφαλο, διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ της κοινωνικής ιεραρχίας και της επιγενετικής δράσης της οιστραδιόλης, στην τροποποίηση των κυκλωμάτων που προσδιορίστηκαν ότι συμβάλλουν στην ιεραρχική συμπεριφορά. Μετά από επταήμερη χορήγηση Ε2 σε δυάδες αρσενικών zebrafish με σταθερές κοινωνικές δομές ποσοτικοποιήθηκαν οι δείκτες κυριαρχίας, ο ρυθμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού και η κατανομή των α2Α και β2 ΑΥ. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ δείκτη κυριαρχίας των ατόμων που έλαβαν Ε2 για 7 μέρες και ατόμων ελέγχου, καθώς και τροποποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στις περιοχές επίδρασης της ιεραρχικής συμπεριφοράς στον τελεγκέφαλο και την παρεγκεφαλίδα των κυρίαρχων και υποτελών ατόμων.Τα αποτελέσματα από την παρούσα διατριβή καταδεικνύουν την ύπαρξη επιγενετικών μηχανισμών πλαστικότητας στον εγκέφαλο του Danio rerio που σχετίζονται με τη λειτουργία του αδρενεργικού συστήματος και τη δομική πλαστικότητα με την παραγωγή νέων κυττάρων. Τα οιστρογόνα αλλά και η ιεραρχική κοινωνική συμπεριφορά φαίνεται πως αποτελούν σημαντικούς ρυθμιστές των νευρωνικών κυκλωμάτων του εγκεφάλου των ιχθύων, επηρεάζοντας αξιοσημείωτα τη νευρογένεση και τη λειτουργία νευροδιαβιβαστικών κυκλωμάτων.