Χαρτογράφηση και καθορισμός των β-λεμφοκυτταρικών επιτόπων εντός πρωτεϊνων της επιφάνειας του streptococcus pneumaniae με σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων για τη μελέτη της ανοσολογικής απόκρισης της διεισυκτική πνευμονοκοκκική νόσο σε παιδιατρικούς ασθενείς

Abstract

Our study focused on the identification of immunodominant B cell epitopes within surface pneumococcal virulence proteins in pediatric patients with invasive pneumococcal disease (IPD). To this aim, we evaluated sera from children with IPD against 141 20-mer synthetic peptides covering the entire sequence of major, previously identified, antigenic fragments within pneumococcal virulence proteins; namely the choline-binding protein D (CbpD), the pneumococcal histidine triad proteins (PhtD and PhtE), th pneumococcal surface protein A (PspA), the plasminogen and fibronectin binding protein B (PfbB) and the zinc metalloproteinase B (ZmpB). Ten immunodominant B cell epitopes were identified: CbpD-pep4 (amino acids (aa) 291-310), PhtD-pep11 (aa 88-107), PhtD-pep17 (aa 172-191), PhtD-pep19 (aa 200-219), PhtE-pep32 (aa 300-319), PhtE-pep40 (aa 79-98), PfbB-pep76 (aa 180-199), PfbB-pep79 (aa 222-241), PfbB-pep90 (aa 484-503) and ZmpB-pep125 (aa 431-450). All epitopes were highly conserved among different pneumococcal serotypes, while four of them were located within the functional zinc-binding domain of the histidine triad proteins PhtD and PhtE. Peptides CbpD-pep4, PhtD-pep19 and PhtE-pep40 were broadly recognized by IPD patients’ sera with prevalence of 96.4%, 92.9%, and 71.4% respectively, whereas controls’ sera exhibited only minor reactivities (<10.7%). Peptides’ specificities for IPD were 93.3%, 95%, and 96.7%, their sensitivities were 96.4%, 92.9% and 71.4% and their positivity likelihood ratios for IPD were 14.5, 18.6 and 21.4 respectively. Furthermore, purified antibodies against CbpD-pep4, PhtD-pep19, and PhtE-pep40 readily bound on the surface of different pneumococcal serotypes, as assessed by FACS and immunofluorescence analysis.

Η παρούσα διατριβή είχε σκοπό την ανίχνευση των ανοσοκυρίαρχων Β-λεμφοκυτταρικών επιτόπων εντός πρωτεϊνών της επιφάνειας του πνευμονιοκόκκου που συμμετέχουν στη λοιμογόνο δύναμη του βακτηρίου; η προσέγγιση αυτή είναι ιδιαίτερα σημαντική για το σχεδιασμό νέων εμβολίων. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε ορούς παιδιών με διεισδυτική πνευμονιοκοκκική νόσο αναφορικά με την αντιγονικότητά τους έναντι 141 20-μερών συνθετικών πεπτιδίων που κάλυπταν ολόκληρη την αλληλουχία των αντιγονικών τμημάτων εντός των πρωτεϊνών CbpD, PhtD, PhtE, PspA, PfbB και ZmpB που είχαν προσδιοριστεί από προηγούμενη μελέτη. Ανιχνεύτηκαν 10 ανοσοκυρίαρχοι Β-λεμφοκυτταρικοί επίτοποι με αμινοξική αλληλουχία (αα): CbpD-pep4 (aa 291-310), PhtD-pep11 (αα 88-107), PhtD-pep17 (αα 172-191), PhtD-pep19 (αα 200-219), PhtE-pep32 (αα 300-319), PhtE-pep40 (αα 79-98), PfbB-pep76 (αα 180-199), PfbB-pep79 (αα 222-241), PfbB-pep90 (αα 484-503 ) και ZmpB-pep125 (αα 431-450). Όλοι οι επίτοποι ήταν κοινοί στην πλειοψηφία των πνευμονιοκοκκικών οροτύπων, ενώ τέσσερις από αυτούς, PhtD-pep17, PhtD-pep19, PhtE-pep32 και PhtE-pep40, εντοπίστηκαν εντός της λειτουργικής περιοχής σύνδεσης του Zn2+ των αντίστοιχων πατρικών πρωτεϊνών. Οι επίτοποι CbpD-pep4, PhtD-pep19 και PhtE-pep40 αναγνωρίστηκαν από την πλειοψηφία των ασθενών με διεισδυτική πνευμονιοκοκκική νόσο με ποσοστά 96,4%, 92.9% και 71.4% αντίστοιχα, ενώ οι οροί των μαρτύρων παρουσίασαν μικρού βαθμού αντιδραστικότητα με όλα τα πεπτίδια (<10,7%). Για τα πεπτίδια αυτά η ειδικότητα για τη διεισδυτική πνευμονιοκοκκική λοίμωξη ήταν 93.3%, 95% και 96.7%, ενώ η ευαισθησία ήταν 96.4%, 92.9% και 71.4% και η θετική προγνωστική αξία 14.5, 18.6 και 21.4 αντίστοιχα. Επιπλέον, κεκαθαρμένα αντισώματα έναντι των CbpD-pep4, PhtD-pep19 και PhtE-pep40 συνδέθηκαν στην επιφάνεια ζώντων πνευμονιοκόκκων διαφορετικών οροτύπων όπως αποδείχτηκε με πειράματα κυτταρομετρίας ροής και μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού.