Νευροπεπτίδια και φλεγμονή του εντέρου: ρόλος στη μεταφλεγμονώδη ιστική αναγέννηση

Abstract

In the current study, we aim to evaluate the role of CRH in the process of tissue regeneration under pathological conditions and to clarify putative interactions with other homeostatic mechanisms, such as the immune response, epithelial regeneration and autophagy. For this purpose, we used the model of DSS induced colitis. In this model, Crh-/- mice exhibit decreased survival rates, characterized by increased protein levels of proinflammatory cytokines TNFalpha, IL1beta and IL12p70 and particularly IL6, which was elevated even before the initiation of DSS administration (baseline). In terms of tissue regeneration, Wnt/beta catenin pathway is downregulated due to CRH deficiency. The direct effect of CRH was further confirmed with the utilization of model organisms, such as zebrafish, revealing a conserved function of the stress hormone, CRH.Subsequently, analysis of the regulation of macroautophagy in Crh-/- colon, suggested that CRH deficiency results in upregulated autophagic activation under baseline conditions compared to WT mice. Administration of the autophagic inhibitor, 3-Methyladenine, increased life expectancy of Crh-/- mice following DSS administration and limited the excessive cytokines secretion. In vitro, aminoacid deprivation in Mouse Embryonic Fibroblasts and LPS-induced autophagy in murine macrophages, confirmed the hypothesis that there is a negative correlation between autophagy and CRH.Considering the known interaction between autophagy and inflammasomes, we searched for a putative interaction between CRH deficiency and inflammasome activation. Crh-/- mice have increased intestinal bacterial load and activated inflammasome, while broad spectrum antibiotics administration prior to and during DSS administration, resulted in the amelioration of the inflammatory response in Crh-/- mice, along with high survival rates characterized by low body weight loss and complete tissue regeneration.In order to test whether the upregulated protein levels of IL6 in Crh-/- mice under baseline conditions, are responsible for the subsequent dysregulation of the inflammatory response and the individual homeostatic mechanisms, we used the pharmacological inhibitor of IL6 receptor. The inhibition of the biological effect of IL6, resulted in the amelioration of the histopathological features and increased the survival rate of Crh-/- mice. Our experimental data imply the synergistic effect of CRH and IL6, which is revealed when one of these two factors is absent or dysfunctional, leading to development of colitis.For the first time, we provide a generalized approach for the understanding of CRH participation in IBD pathogenesis and the orchestration of the individual homeostatic mechanisms through tissue response to inflammatory stress. Based on our findings, CRH contributes in the host immune response both under baseline conditions and following an inflammatory stimulus, by controlling, among others, the abundance and the composition of the microbiome. The clarification of the exact order of events that follow CRH deficiency may provide therapeutic targets, based on the stage of the disease and the inflammatory response.

Με την παρούσα μελέτη στοχεύσαμε στην αξιολόγηση του ρόλου της CRH στην διαδικασία της ιστικής αναγέννησης κάτω από παθολογικές συνθήκες και στην αποσαφήνιση των ενδεχόμενων αλληλεπιδράσεών του με άλλους ομοιοστατικούς μηχανισμούς όπως η ανοσολογική απόκριση, η επιθηλιακή αναγέννηση και η αυτοφαγία. Για αυτούς τους λόγους χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο της χημικά επαγόμενης κολίτιδας, όπου οι Crh-/- μύες εμφανίζουν υψηλή θνησιμότητα, αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα των προφλεγμονωδών πρωτεϊνών, TNFα, IL1β και IL12p70 και αυξημένα επίπεδα IL6 πριν την έναρξη της φλεγμονώδους διαδικασίας. Η έλλειψη της CRH οδηγεί σε διαταραχή του αριθμού και της μορφολογίας των επιθηλιακών κυτταρικών τύπων, η οποία συνδέθηκε με την αρνητική ρύθμιση του μονοπατιού Wnt / β κατενίνης. Απευθείας δράση της CRH στη ρύθμιση του μονοπατιού Wnt / β κατενίνης επιβεβαιώθηκε και με τη βοήθεια μοντέλων – οργανισμών όπως το zebrafish, αποκαλύπτοντας μια συντηρημένη δράση της ορμόνης του stress. Στη συνέχεια, η ανάλυση της παρουσίας της αυτοφαγίας στο έντερο των Crh-/- μυών οδήγησε στο συμπέρασμα ότι εμφανίζουν ενεργοποιημένο αυτοφαγικό μηχανισμό ήδη από συνθήκες ελέγχου. Η χορήγηση του αναστολέα της αυτοφαγίας, 3-Methyladenine, οδήγησε σε αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης των Crh-/- μυών μετά από χορήγηση DSS, ενώ περιόρισε την ανεξέλεγκτη έκκριση κυτοκινών. In vitro, η υστέρηση αμινοξέων σε εμβρυονικούς ινοβλάστες μυός και η μέσω LPS επαγόμενη αυτοφαγία σε μακροφάγα μυός Raw264.7 επιβεβαιώνουν την αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στην CRH και την αυτοφαγία.Ακολούθως, αναζητήσαμε μία ενδεχόμενη αλληλεπίδραση μεταξύ της απαλοιφής της CRH και της ενεργοποίησης του inflammasome. Οι Crh-/- μύες εμφανίζουν αυξημένο βακτηριακό φορτίο και ενεργοποιημένο inflammasome, ενώ η χορήγηση αντιβιοτικών ευρέως φάσματος και η επακόλουθη απαλοιφή των μικροβιωτικών οργανισμών του εντέρου πριν και καθόλη τη διάρκεια της χορήγησης DSS, είχε ως αποτέλεσμα υψηλά επίπεδα επιβίωσης συνοδευόμενα από περιορισμένη απώλεια βάρους και πλήρη ιστική επιδιόρθωση. Για να ελέγξουμε την υπόθεση ότι τα αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα IL6 στους Crh-/- μύες σε συνθήκες ελέγχου ευθύνονται για την μετέπειτα απορρύθμιση της φλεγμονώδους αντίδρασης και των επιμέρους ομοιοστατικών μηχανισμών που περιγράφησαν (αυτοφαγία, ενεργοποίηση inflammasomes) χρησιμοποιήσαμε τον φαρμακολογικό αναστολέα του υποδοχέα του IL6. Η αναστολή της βιολογικής δράσης της IL6, οδήγησε σε δραστική βελτίωση της ιστολογικής εικόνας, θεαματική αύξηση της επιβίωσης των Crh-/- μυών, και παράλληλη απώλεια βάρους πανομοιότυπη με τα ζώα αγρίου τύπου. Για πρώτη φορά παρέχουμε μια γενικευμένη θεώρηση για τη συμμετοχή της CRH στην ενορχήστρωση των επιμέρους ομοιοστατικών μηχανισμών μέσω της ιστικής αντίδρασης στο φλεγμονώδες stress. Με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, η CRH συμμετέχει στην ανοσολογική αντίδραση του ξενιστή τόσο υπό συνθήκες ελέγχου, όσο και μετά από ένα φλεγμονώδες ερέθισμα ελέγχοντας εκτός των άλλων και την αφθονία και τη σύσταση των συμβιωτικών βακτηρίων. Η αποσαφήνιση της σειράς των γεγονότων που ακολουθούν την γενετική απαλοιφή της CRH μπορεί να παρέχει στόχους για θεραπευτικές προσεγγίσεις, ανάλογα με το στάδιο και την πορεία της φλεγμονής.