Η έκφραση του πεπτιδίου επέκτασης (E-peptide) του IGF-1 στην κυτταρική σειρά SK-UT-1 και σε ιστούς ανθρώπου και τρωκτικών

Abstract

Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) has endocrine and autocrine/paracrine actions that regulates the pre- and postnatal development in many cell types and tissues of both human and rodent origin. The igf-1 gene, contains six exons, and gives rise to multiple, heterogeneous transcripts (mRNA) by a combination of: a) alternative usage of promoters, b) alternative splicing and c) different polyadenylation signals. These multiple IGF-1 transcripts encode different precursor peptides, which could undergo post-translational modification. Briefly, are encoded the mature IGF-1 peptide and the E-peptides. In humans are potentially produced three E-peptides (Ea, Eb and Ec), while in rodents two (Ea and Eb). Therefore, the objectives of the present study are to demonstrate the existence of Ec/Eb peptides and investigate their biological activity in an in vitro model. By immunobloting, with a polyclonal anti-IGF-1Ec antibody, we detected the pro-form and the E-peptide in various tissues and verified that the peptide can be derived from proteolysis of the precursor peptide, through the action of the furin enzyme. To examine the bioactivity of the peptide, a synthetic Eb and Scramble peptide were used. Additional by developing a ligand binding in vitro assay we investigated, whether the synthetic Eb peptide Eb can bind receptor. Finally, we describe a cellular model (SK-UT-1) which does not endogenously express IGF-1 and IGF-1R, and could be utilized for elucidating the biological role of the peptides, independently of the mature IGF-1 peptide.

Ο ινσουλινομιμητικός αυξητικός παράγοντας-1 (IGF-1: Insulin-like growth factor-1) έχει ενδοκρινείς και αυτοκρινείς/παρακρινείς δράσεις που ρυθμίζει την προ και μεταγεννητική ανάπτυξη σε πολλούς τύπους κυττάρων και ιστών τόσο στον άνθρωπο όσο και σε τρωκτικά. Το γονίδιο του (igf-1), περιέχει έξι εξώνια και δίνει γένεση σε πολλαπλά, ετερογενή μετάγραφα (mRNA) μέσω ενός συνδυασμού: α) εναλλακτικής χρήσης υποκινητών, β) εναλλακτικού ματίσματος και γ) διαφορετικών σημάτων πολυαδενυλίωσης. Αυτά τα πολλαπλά μετάγραφα του IGF-1 κωδικοποιούν διαφορετικές ισομορφές του πρόδρομου πεπτιδίου του, οι οποίες, επίσης, υφίστανται μετά-μεταφραστική τροποποίηση. Εν συντομία, κωδικοποιούνται; το ώριμο πεπτίδιο του IGF-1 και μια καρβοξυτελική επέκταση που ονομάζεται E-πεπτίδιο. Στους ανθρώπους παράγονται, υποθετικά, 3 Ε-πεπτίδια (Ea, Eb και Ec), ενώ στα τρωκτικά 2 (Ea και Eb). Ως εκ τούτου, οι στόχοι της παρούσας διατριβής ήταν η ανίχνευση των πεπτιδίων Ec και Eb και η διερεύνηση της βιολογικής τους δράση σε in vitro μοντέλα. Εντοπίστηκε μέσω ανοσοανίχνευσης με πολυκλωνικό anti-IGF-1Ec αντίσωμα, η ενδογενώς παραγόμενη ισομορφή και ανιχνεύτηκε το πεπτίδιο της σε μια σειρά από ιστούς. Επιπλέον επαληθεύτηκε ότι το πεπτίδιο αυτό μπορεί να προέλθει από πρωτεϊνόλυση του πρόδρομου πεπτιδίου του, μέσω της δράσης του ενζύμου φουρίνης. Για να εξεταστεί η βιοδραστικότητα του πεπτιδίου, χρησιμοποιήθηκε συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στην αμινοξική ακολουθία του Eb των τρωκτικών και πεπτίδιο με τυχαία ακολουθία αμινοξέων. Επιπρόσθετα μέσω μιας in vitro δοκιμής δέσμευσης προσδέτη από τον υποδοχέα του IGF-1R διερευνήθηκε αν το συνθετικό πεπτίδιο Eb μπορεί να προσδεθεί στον υποδοχέα. Τέλος, περιγράφετε ένα κυτταρικό μοντέλο (SK-UT-1) το οποίο, δεν εκφράζει, IGF-1 και IGF-1R, και το οποίο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη διαλεύκανση του βιολογικού ρόλου των πεπτιδίων.