Επίδραση της αντιμυλλεριανικής ορμόνης (ΑΜΗ) και της μορφογενετικής πρωτεΐνης 15 (BMP-15) στη στεροειδογένεση από πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων κοκκωδών κυττάρων μέσω του Smad5 σηματοδοτικού μονοπατιού

Abstract

Effect of Anti-Müllerian hormone (AMH) and bone morphogenetic protein 15 (BMP-15) on steroidogenesis in primary-cultured human luteinized granulosa cells through Smad5 signalling.Purpose: To determine if there is any effect of AMH and BMP-15 on estradiol and progesterone production from primary-cultured human luteinized granulosa cells, to delineate what is the effect of FSH on their actions and which are the possible mechanisms involved. Methods: Luteinized granulosa cells (GCs), obtained from follicular fluid of 30 women undergoing in vitro fertilization, were cultured, after a short 24-hour preincubation period, in serum-free medium for 24 or/and 48 hours in the presence/absence of various concentrations of AMH, BMP-15 and FSH alone or in combinations. Estradiol and progesterone production, SMAD5 phosphorylation and StAR expression were studied in parallel. Steroids were measured in culture-supernatant using enzyme-immunoassays, while Smad5-signaling pathway activation and StAR protein expression were assessed immunocytochemically.Result(s): We found that the treatment of AMH in GCs for 24/48 hours attenuated FSH-induced estradiol production (p<0.001), had no effect on basal estradiol levels, decreased basal progesterone production (p<0.001) and FSH-induced StAR expression (p<0.001). On the other hand, BMP-15 decreased basal estradiol levels (p<0.001) and attenuated FSH-induced estradiol production (p<0.001). Furthermore, BMP-15 reduced progesterone basal secretion (p<0.001), an effect that was partially reversed by FSH (p<0.01), probably via increasing StAR expression (p<0.001). FSH-induced StAR expression was also attenuated by BMP-15 (p<0.001). FSH, AMH and BMP-15 activated Smad-signaling pathway, as confirmed by the increase of phospo-Smad5 protein levels (p<0.001 compared to control).Conclusion(s): AMH and BMP-15 by interacting with FSH affect the production of estradiol and progesterone from cultured luteinized-granulosa cells possibly via Smad5-protein phosphorylation.

Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στην προσπάθεια διερεύνησης των δράσεων της αντιμυλλέριας ορμόνης (ΑΜΗ) και της οστικής μορφογενετικής πρωτεΐνης -15 (ΒΜΡ-15) στην παραγωγή οιστραδιόλης (Ε2) και προγεστερόνης (Ρ4) από πρωτογενή ανθρώπινα ωχρινοποιημένα κύτταρα απουσία ή παρουσία της ορμόνης FSH. Τα εμπλεκόμενα ενδοκυττάρια μονοπάτια και οι μηχανισμοί δράσεις αποτέλεσαν επίσης αντικείμενο μελέτης. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν, κατόπιν γραπτής συναίνεσης, ανθρώπινα ωχρινοποιημένα κύτταρα, τα οποία απομονώθηκαν από το ωοθυλακικό υγρό 30 γυναικών, που υποβλήθηκαν σε πρόγραμμα υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Τα κοκκώδη κύτταρα, καλλιεργήθηκαν, μετά από μία περίοδο προεπώασης 24 ωρών, σε καλλιεργητικό υλικό χωρίς ορό παρουσία η απουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων των ορμονών ΑΜΗ, ΒΜΡ-15 και FSH, μεμονωμένα η σε συνδυασμό. Η παραγωγή Ε2 και Ρ4, καθώς επίσης η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Smad5 και η έκφραση της πρωτεΐνης StAR, μελετήθηκαν παράλληλα. Οι στεροειδείς ορμόνες μετρήθηκαν ανοσοενζυμικά στο υπερκείμενο των καλλιεργειών, ενώ η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού, στο οποίο εμπλέκεται η πρωτεΐνη Smad5 και η μέτρηση της έκφρασης της πρωτεΐνης StAR πραγματοποιήθηκαν ανοσοΪστοχημικά.Βρέθηκε ότι η χορήγηση της ΑΜΗ στα ανθρώπινα κοκκώδη κύτταρα για 24 και 48 ώρες εξασθένησε την επαγόμενη από την FSH έκκριση της Ε2 (p<0.001), ενώ δεν εμφάνισε καμία δράση στη βασική έκκριση αυτής. Επίσης, η AMH μείωσε τη βασική παραγωγή Ρ4 (p<0.001) και την επαγόμενη από την FSH έκφραση της πρωτεΐνης StAR (p<0.001). Από την άλλη πλευρά, η ΒΜΡ-15 προκάλεσε μείωση στη βασική έκκριση της Ε2 από τα ανθρώπινα κοκκώδη κύτταρα και παρόμοια με την ΑΜΗ εξασθένισε και αυτή την επαγόμενη από την FSH παραγωγή της Ε2 (p<0.001). Επιπρόσθετα, η ΒΜΡ-15 μείωσε την βασική παραγωγή της Ρ4 (p<0.001), γεγονός που αντιστράφηκε μερικώς με την προσθήκη της FSH στην καλλιέργεια (p<0.01), πιθανότατα λόγω αύξησης των επιπέδων της StAR (p<0.001). Επίσης, η ΒΜΡ-15 προκάλεσε μείωση των επιπέδων της επαγόμενης από την FSH παραγωγή της StAR (p<0.001). Η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού των πρωτεϊνών Smad επιβεβαιώθηκε σε όλες τις περιπτώσεις, εφόσον παρατηρήθηκε αύξηση της φωσφορυλιομένης μορφής της σηματοδοτικής πρωτεΐνης Smad5 (p<0.001 σε σύγκριση με ομάδα ελέγχου). Συμπερασματικά, η ΑΜΗ και η ΒΜΡ-15, αλληλεπιδρώντας με την FSH, επηρεάζουν την παραγωγή της Ε2 και της Ρ4 σε πρωτογενή ανθρώπινα ωχρινοποιημένα κύτταρα, πιθανά μέσω της Smad5 σηματοδότησης. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν ενδείξεις για την πιθανή συμμετοχή των ουσιών αυτών στη διαδικασία στεροειδογένεσης και ωοθυλακικής ωρίμανσης. Περαιτέρω μελέτες κρίνονται απαραίτητες για τη διερεύνηση του ρόλου των ουσιών αυτών στη φυσιολογία της ωοθήκης.