Μελέτη του ρόλου του σηματοδοτικού μονοπατιού του m-TOR σε σχέση με τη λεμφαγγειογένεση στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη

Abstract

Adenocarcinoma of prostate is a major health problem worldwide. The available methods for clinical staging seem to be inefficient, since approximately 10% of patients who will undergo radical prostatectomy for clinically localized disease, harbor metastasis in the regional lymph nodes. Recent studies that utilize lymphangiogenic factors and lymphangiogenesis markers to predict the nodal status trigger the interest in molecular staging. Research studies in breast, cervical and gastric cancers suggest a high correlation between the lymphatic microvessel density (LVD) and nodal metastasis.The conserved mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine/threonine kinase of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT signaling pathway. Many studies suggest a role of m-TOR in angiogenesis via the upregulation of VEGF-A. In lymphangiogenesis the participation of mTOR is more complicated as it seems to be essential for the VEGF-C induced lymphangiogenesis but not for lymphangiogenesis that is induced from VEGF-A. Furthermore it is unclear if the expression of m-TOR correlates with the presence of lymph node metastasis or not. Although studies indicate that the transcription factor COUP-TFII is indispensable for lymphangiogenesis, little is known about the relationship between the transcription factor, mTOR and lymph node metastasis in prostate adenocarcinoma.The aim of this study was to determine the expression status of the activated kinase p-mTOR and compare it with lymphatic parameters (LVD, lymphatic invasion etc.) in patients that were found to have positive lymph nodes and patients with negative lymph node status. The lymphatics were determined with the lymphatic-specific markers D2-40 and LYVE-1. Moreover, we examined the expression of the transcription factor COUP-TFII, the vascular endothelial growth factors A and C (VEGF-A, VEGF-C) in relation to each other, p-mTOR expression, mean LVD, lymphatic invasion and lymph node status.In order to accomplish our objective paraffin-embedded tissues obtained from 92 patients who underwent radical prostatectomy were immunostained with p-mTOR, D2-40, CD-31, LYVE-1, VEGF-C, VEGF-A and COUP-TFII antibodies. The associations between the results were analyzed with statistical analysis protocols.In the current study, peritumoral (but not intratumoral) mean LVD assessed by D2-40 was higher in pN1 tumors. Intensity of p-mTOR staining was higher in carcinomas with lymph node metastasis than in those with negative lymph nodes. Furthermore, higher p-mTOR cytoplasmic expression was strongly associated with LVD and lymphatic invasion. Intense VEGF-C, VEGF-A and COUP-TFII immunostaining was observed in N1 cases and correlated with the presence of lymphatic emboli and higher p-mTOR expression. Finally the number of COUP-TFII positive vessels was positively associated with lymph node metastasis and lymphatic invasion. Our findings suggest that both D2-40 and LYVE-1 are useful markers that may reveal lymphatic vasculature, the latter however showing lower expression, probably limited to a specific lymphatic vessel cellular sub-population. Activation of mTOR pathway may facilitate nodal metastasis, possibly due to increased lymphangiogenesis and lymphatic vessel invasion via increased VEGF-C and VEGF-A expression. Additionally our results indicate that COUP-TFII may facilitate not only neo-lymphangiogenesis but also promotes lymphatic invasion. Finally it seems that newly formed lymphatic vessels are more important than mature ones for lymphatic spread in prostate adenocarcinoma.

Το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη αποτελεί σημαντικό πρόβλημα υγείας σε παγκόσμια κλίμακα. Οι διαθέσιμες μέθοδοι κλινικής σταδιοποίησης φαίνεται να μην επαρκούν εφόσον 10% περίπου των ασθενών στους οποίους διαγιγνώσκεται εντοπισμένη νόσος και υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή εμφανίζουν ήδη μετάσταση στους λεμφαδένες. Το αναπτυσσόμενο ενδιαφέρον για τη μοριακή σταδιοποίηση βασίζεται στα αποτελέσματα μελετών που χρησιμοποιούν δείκτες λεμφαγγείων και λεμφαγγειογενετικούς παράγοντες στην πρόβλεψη της κατάστασης των λεμφαδένων. Ερευνητικές μελέτες στο καρκίνωμα του μαστού, του τραχήλου και του στομάχου υποδεικνύουν τη στενή σχέση ανάμεσα στη λεμφαγγειακή πυκνότητα (LVD) και τις λεμφαδενικές μεταστάσεις.Ο διατηρημένος στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) αποτελεί κινάση σερίνης/θρεονίνης του σηματοδοτικού μονοπατιού (PI3K)/AKT. Μεγάλος αριθμός μελετών υποδεικνύει το πιθανό ρόλο του m-TOR στην αγγειογένεση μέσω της επαγωγής του VEGF-A. Αποτελέσματα μελετών συνδέουν τη κινάση m-TOR με την αγγειογένεση μέσω της επαγωγής του αυξητικού παράγοντα VEGF-A. Η συμμετοχή του mTOR στη λεμφαγγειογένεση δεν είναι τόσο σαφής εφόσον φαίνεται να κατέχει σημαντικό ρόλο στην επαγόμενη λεμφαγγειογένεση από τον VEGF-C αλλά όχι από τον VEGF-A. Επιπλέον παραμένει ασαφές εάν η έκφραση του m-TOR συνδέεται με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. Παρόλο που ο COUP-TFII είναι απαραίτητος για τη λεμφαγγειογένεση, ελάχιστα είναι γνωστά για τη σχέση ανάμεσα στον μεταγραφικό παράγοντα το mTOR και τη δημιουργία λεμφαδενικών μεταστάσεων στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της έκφρασης της ενεργοποιημένης κινάσης (p-mTOR) και η σύγκριση της με παραμέτρους που σχετίζονται με τα λεμφαγγεία (LVD, παρουσία καρκινικών εμβόλων κτλ) σε ασθενείς με αρνητικούς και θετικούς λεμφαδένες. Τα λεμφαγγεία καθορίσθηκαν από τους ειδικούς δείκτες D2-40 και LYVE-1. Επιπλέον εξετάσαμε την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα COUP-TFII και των αυξητικών παραγόντων VEGF-A και VEGF-C σε σχέση με την έκφραση του p-mTOR τη μέση λεμφαγγειακή πυκνότητα την παρουσία εμβόλων και την κατάσταση των λεμφαδένων. Για να επιτευχθεί ο στόχος της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν ιστοί εγκλεισμένοι σε παραφίνη από 92 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε ριζική προστατεκτομή. Εφαρμόσθηκε ανοσοϊστοχημική μέθοδος, χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι των p-mTOR, D2-40, CD-31, LYVE-1, VEGF-C, VEGF-A και COUP-TFII. Οι σχέσεις ανάμεσα στα αποτελέσματα εξετάσθηκαν με πρωτόκολλα στατιστικής ανάλυσης. Στην παρούσα μελέτη, η περιφερική του όγκου LVD η οποία καθορίσθηκε από το D2-40 ήταν αυξημένη στα περιστατικά με pN1. Η ένταση και η κατανομή της ανοσοϊστοχημικής χρώσης για το p-mTOR ήταν αυξημένη στα καρκινώματα με λεμφαδενικές μεταστάσεις σε σχέση με αυτά που παρουσίαζαν αρνητικούς λεμφαδένες. Επιπλέον, τα περιστατικά με εντονότερη κυτταροπλασματική έκφραση του p-mTOR παρουσίασαν αυξημένη LVD και μεγαλύτερο αριθμό διηθημένων λεμφαγγείων. Αντίστοιχα οι περιπτώσεις με pN1 παρουσίασαν εντονότερο ανοσοϊστοχημικό εντοπισμό των VEGF-C, VEGF-A και COUP-TFII που επίσης σχετίσθηκε με την παρουσία περισσότερων λεμφαγγειακών εμβόλων και με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του p-mTOR. Τέλος ο αριθμός των COUP-TFII θετικών αγγείων ήταν μεγαλύτερος στα περιστατικά με λεμφαδενικές μεταστάσεις και διηθημένα λεμφαγγεία. Τα ευρήματα μας υποδεικνύουν ότι τόσο το D2-40 όσο και το LYVE-1 αποτελούν ειδικούς δείκτες για τον εντοπισμό των λεμφαγγείων. Παρόλα αυτά η έκφραση του LYVE-1 περιοριζόταν σε έναν υποπληθυσμό λεμφαγγείων ελαττώνοντας την ευαισθησία του μορίου ως δείκτη. Η ενεργοποίηση του mTOR σηματοδοτικού μονοπατιού φαίνεται να διευκολύνει τη δημιουργία λεμφαδενικών μεταστάσεων πιθανώς επάγοντας την έκφραση των VEGF-C και VEGF-A. Η επαγωγή των αυξητικών παραγόντων έχει ως επακόλουθο την δημιουργία νέων λεμφαγγείων και πιθανόν την αύξηση της διαπερατότητας τους. Επιπλέον τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι ο COUP-TFII ευοδώνει όχι μόνο τη νέο-λεμφαγγειογένεση αλλά και τη λεμφαγγειακή διήθηση. Τέλος μπορεί να υποτεθεί ότι τα νεοδημιουργηθέντα λεμφαγγεία είναι σημαντικότερα από τα ώριμα για τη εξάπλωση του προστατικού αδενοκαρκινώματος στους επιχώριους λεμφαδένες.